《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Developmental hepatotoxicity of liquid crystal monomers in zebrafish: hepatic lipid accumulation and metabolic disruption
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液晶单体（LCMs）作为液晶显示器（LCDs）的关键材料，因其持久性、生物蓄积性和毒性（PBT）特征而日益受到关注。本研究选取四种代表性氟化液晶单体（2O3cHdFP、tFPO-CF2-dF3B、2O3cHdFB和TPrCB），以环境相关浓度对肝脏特异性荧光转
液晶单体（LCMs）作为液晶显示器（LCDs）的关键材料，因其持久性、生物蓄积性和毒性（PBT）特征而日益受到关注。本研究选取四种代表性氟化液晶单体（2O3cHdFP、tFPO-CF2-dF3B、2O3cHdFB和TPrCB），以环境相关浓度对肝脏特异性荧光转基因斑马鱼Tg(ela3l:EGFP; fabp10a:DsRed)进行2至144小时受精后（hpf）的发育期暴露。研究结果表明，所有四种LCMs均显著降低肝脏荧光面积和强度，抑制肝脏发育。油红O染色和生化检测显示，LCMs暴露导致肝细胞内脂滴异常沉积，甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平呈浓度依赖性升高，同时丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）等肝功能指标显著改变，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）等氧化应激指标亦明显升高。转录组学分析揭示，LCMs暴露引起与脂质代谢、胰岛素信号、炎症反应、线粒体功能障碍和细胞凋亡相关的差异表达基因（DEGs）显著富集，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路相关基因pparg在多数暴露组中显著上调。分子对接预测LCMs可能与PPARγ、胰岛素受体（INSR）和肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）存在潜在相互作用。PPARγ拮抗剂GW9662的干预实验进一步证实，药理学抑制PPARγ可有效缓解LCMs诱导的肝脏脂质蓄积，表明PPARγ相关信号通路参与LCMs的肝毒性机制。研究首次将发育期暴露于新型氟化LCMs与早期生命阶段脊椎动物模型中NAFLD样肝表型相关联，提示环境LCM暴露可能对儿童代谢性肝脏疾病构成潜在风险。
论文解读
一、研究背景与目的
液晶单体（LCMs）是液晶显示器（LCDs）的核心功能材料，其分子结构通常由联苯或双环己烷骨架构成，并带有烷氧基、烷基、氰基和氟代等取代基。随着全球LCD年出货量从2010年的1.13亿平方米预计增长至2025年的2.38亿平方米，LCMs在液晶显示器全生命周期（生产、消费使用和废弃处理）中不可避免地释放到环境中。已有监测数据显示，LCD拆解车间室内灰尘中LCMs中位浓度高达67,400 ng/g，中国珠江沉积物中浓度为0.9至31.1 ng/g，粤港澳大湾区城市表层土壤中检出浓度为250 ng/g，香港和深圳垃圾填埋场渗滤液中LCMs浓度分别为1,120 ng/L和409 ng/L。更为值得关注的是，城市居民血清中LCMs浓度为3.16至28.5 ng/mL（中位值9.59 ng/mL），电子废物拆解工人血清中浓度为7.78至276 ng/mL（中位值35.2 ng/mL），北京居民母乳样品中LCMs浓度范围为11.97至28,200 ng/g脂重。这些检出浓度已与氯丹、多氯联苯（PCBs）和二氯乙烷等广泛关注的污染物水平相当。
LCMs作为持久性、生物蓄积性和毒性（PBT）污染物，已被证实对水生和陆生生物具有多种毒性效应，包括对表皮葡萄球菌的剂量依赖性抑菌作用、大型蚤的氧化应激和神经传导损伤、斑马鱼的甲状腺激素稳态紊乱以及人支气管上皮细胞的活性氧（ROS）生成和肺毒性。肝脏作为脂质代谢和解毒的核心器官，已被确定为多种环境污染物的主要毒理学靶点。已有研究表明，微塑料、草甘膦和双酚S等多种污染物均可诱导肝脏脂质蓄积。尽管已有研究报道某些LCMs可在水生和陆生生物中生物蓄积并诱导肝脏形态异常、转氨酶水平升高和脂质代谢紊乱，但现有研究主要聚焦于成体阶段，LCMs是否干扰早期生命阶段的肝脏发育和功能仍 largely unexplored。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）以肝细胞内过量脂质蓄积为特征，其发病机制涉及脂质代谢失调、胰岛素抵抗、炎症和细胞应激的复杂相互作用，关键分子机制包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）失调、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号级联受损、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的炎症反应、线粒体功能障碍和细胞凋亡等。因此，确定LCMs是否具有在早期发育阶段干扰这些通路的潜力，从而诱发NAFLD样肝脏表型，具有重要的生态和人类健康风险意义。
二、研究设计与技术方法
研究人员选取四种代表性氟化LCMs，即2O3cHdFP（CAS: 174350–05-1）、tFPO-CF2dF3B（CAS: 303186–20-1）、2O3cHdFB（CAS: 189750–98-9）和TPrCB（CAS: 131819–23-3），均购自上海J&K Chemical Ltd.，纯度>98%。采用肝脏特异性荧光转基因斑马鱼Tg(ela3l:EGFP; fabp10a:DsRed)（来源于中国斑马鱼资源中心，武汉），将受精后2小时（hpf）的胚胎随机分配至6孔板（每孔10枚胚胎，每组总计n=300），暴露浓度依据垃圾填埋场渗滤液报告浓度和既往毒性研究设定为低、中、高三个水平：2O3cHdFP（3、30、300 ng/L）、tFPO-CF2-dF3B（1、10、100 ng/L）、2O3cHdFB（0.45、4.5、45 ng/L）和TPrCB（0.5、5、50 μg/L），所有处理组含0.01%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂对照，暴露溶液每24小时更换直至144 hpf，每组设三个平行暴露重复。主要技术方法包括：GC-MS/MS定量暴露溶液中LCMs浓度；荧光立体显微镜活体成像和ImageJ定量肝脏荧光面积和强度；苏木精-伊红（H&E）染色和油红O染色进行组织病理学观察；生化试剂盒检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）；Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序（RNA-seq）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达；AutoDock 4.2.6进行分子对接模拟；以及PPARγ拮抗剂GW9662（0.5 μM）干预的救援实验。所有动物实验经中国环境科学研究院研究伦理委员会批准（批准号：CRAES IRB 20240903）。
三、研究结果
3.1 化学分析
GC-MS/MS测定结果显示，四种LCMs在对照溶液中均未检出，实测浓度分别为相应名义浓度的71.04%–128.73%（2O3cHdFP）、85.85%–128.74%（tFPO-CF2-dF3B）、90.62%–117.60%（2O3cHdFB）和85.70%–115.57%（TPrCB），实测浓度在整个暴露期间与名义浓度总体一致。
3.2 LCMs的发育性肝毒性
144 hpf时肝脏特异性荧光转基因斑马鱼活体成像显示，四种LCMs均能显著降低肝脏荧光面积和强度（p<0.05）。tFPO-CF2-dF3B在高浓度下表现出最强的抑制作用，荧光面积减少40.37%，强度减少16.35%（p<0.01）；TPrCB敏感性最高，低浓度即导致荧光面积减少14.99%（p<0.05）；2O3cHdFP呈剂量依赖性效应，最高浓度下面积减少12.39%、强度减少6.58%（p<0.05）；2O3cHdFB虽未引起强度显著变化，但中浓度和高浓度下荧光面积分别减少15.99%（p<0.05）和31.00%（p<0.01）。这些结果表明，LCMs早期发育期暴露导致斑马鱼肝脏体积显著减小和肝脏器官发生受损，荧光强度同步降低提示肝细胞功能受损。
3.3 LCMs诱导的肝脏形态学改变和脂质蓄积
油红O染色显示，对照组肝脏仅有极少量红色脂滴，而所有LCMs暴露组肝脏区域均出现不同程度的红色脂滴沉积，脂滴面积百分比均显著高于对照组（p<0.05），其中TPrCB组脂质沉积最为严重。H&E染色分析显示，与对照组相比，LCMs暴露组呈现明显的组织病理学异常，如进行性空泡化，tFPO-CF2-dF3B、2O3cHdFB和TPrCB组的空泡化程度较2O3cHdFP组更为显著，且2O3cHdFP和tFPO-CF2-dF3B组特异性观察到细胞核变形。这些发现表明LCMs在斑马鱼早期发育阶段诱导不同程度的肝脏异常脂质蓄积，并伴随肝细胞形态学损伤。
3.4 脂质代谢紊乱、肝毒性和氧化应激
生化检测显示，LCMs暴露后TC和TG水平呈浓度依赖性升高。2O3cHdFP和tFPO-CF2-dF3B各浓度组TC水平均显著升高（p<0.05），2O3cHdFP低、中、高浓度分别增加34.68%、42.85%和54.68%，tFPO-CF2-dF3B分别增加38.61%、40.49%和44.64%；两种LCMs最高TG水平出现在最高暴露浓度，分别较对照组显著增加62.35%和59.84%（p<0.05）。2O3cHdFB仅高浓度组TC和TG显著升高（p<0.05），分别增加44.12%和47.69%。TPrCB在高浓度组引起最大脂质扰动，TC和TG分别增加80.45%和73.33%。四种LCM结构中，环己烷比例较高者与TC和TG相对更大的升高相关。肝功能方面，除2O3cHdFB的AST无显著变化外，其余LCMs均至少在一种浓度组引起AST、ALT或ALP显著改变（p<0.05），其中高浓度TPrCB组ALT和AST升高最为显著，分别增加55.02%和44.37%。氧化应激方面，所有LCMs处理组SOD（9.57%–46.69%）和CAT（12.34%–37.65%）均显著上调（p<0.05），2O3cHdFB各浓度组MDA水平均显著升高（p<0.05），低、中、高浓度分别增加22.29%、33.66%和40.94%。
3.5 基因富集和表达模式分析
RNA-seq分析鉴定出差异表达基因（DEGs）：2O3cHdFP组337个（180个上调、157个下调），tFPO-CF2-dF3B组758个（462个上调、296个下调），2O3cHdFB组1,400个（131个上调、1,269个下调），TPrCB组878个（200个上调、678个下调）。Venn分析鉴定出12个在四种LCMs暴露组中一致改变的DEGs，包括si:dkey-22f5.9、cr63690.7.1、gata5、a2ml、socs3a、cox6a2、fosab、blvra、ins、ptgs2a、hnf1bb和casp22，这些共享DEGs与胰岛素信号调控、肝细胞分化、线粒体能量代谢、应激反应和细胞凋亡等生物学过程相关。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析进一步鉴定出ikbkb、cox6a2、cox5b、mt-co1/2、cox4il、casp22和casp3b等关键DEGs，提示线粒体功能、炎症反应和凋亡相关通路的协调转录改变。
KEGG通路富集分析显示，所有LCMs组共同富集的通路包括NAFLD、TNF信号通路、胰岛素抵抗、IL-17信号通路、脂质与动脉粥样硬化，与观察到的脂质蓄积、炎症和肝脏损伤一致。特定LCMs组还富集到其他NAFLD相关通路，如催乳素信号通路（tFPO-CF2-dF3B、2O3cHdFB和TPrCB组）、脂肪细胞因子信号通路（tFPO-CF2-dF3B组）、氧化磷酸化（2O3cHdFP组）、化学致癌-活性氧（2O3cHdFP和TPrCB组）和细胞凋亡（tFPO-CF2-dF3B、2O3cHdFB和TPrCB组）。GO富集分析显示所有组均富集肝脏发育和动物器官发育相关条目，与肝脏荧光面积和强度显著降低的观察结果一致；2O3cHdFP和tFPO-CF2-dF3B组还富集线粒体呼吸链复合物IV相关条目。
WGCNA分析鉴定出三个高度相关模块：turquoise（93个基因）、blue（54个基因）和gray（7个基因），所有模块均显著富集肝脏发育和NAFLD相关条目，其中turquoise模块与胰岛素信号通路相关，blue模块与线粒体功能相关过程相关。基因-生化指标相关性分析显示，nkfb1（TC/AST/ALT/ALP）与炎症、脂质代谢和凋亡相关，bmp2b（TC/TG/ALP）与胚胎和肝脏发育相关，srebf1（TC）与脂肪酸和胆固醇代谢相关，lrp5和pparab（TC）与脂质调控相关，mapk8b（AST/MDA）与凋亡、炎症信号和氧化应激相关，pi3kca（AST）参与PI3K/AKT介导的细胞增殖，gls2b（ALT/SOD）参与能量代谢和凋亡调控，blvra（CAT）参与抗氧化防御和细胞保护。
qRT-PCR验证结果显示，pik3r3a仅在tFPO-CF2-dF3B组显著下调（p<0.05），cox6a2在除TPrCB外的所有LCMs暴露组均显著抑制（p<0.05），pparg在除tFPO-CF2-dF3B外的所有组均显著上调（p<0.05），socs3a无显著变化，验证了RNA-seq的转录变化。
3.6 分子对接
分子对接模拟预测LCMs与PPARγ、胰岛素受体（INSR）和肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的潜在结合相互作用，包括疏水相互作用、氢键、垂直π–π堆积和卤键。四种LCMs中，2O3cHdFB表现出最有利的预测结合能。对接结果提示LCMs与这些受体存在潜在相互作用。
3.7 救援实验
PPARγ拮抗剂GW9662（0.5 μM）共暴露显著减轻了LCMs诱导的脂质蓄积。油红O染色显示，除2O3cHdFP 300 ng/L + GW9662组外，所有共处理组肝脏脂滴均显著减少。生化分析显示，所有LCM + GW9662组的TG水平恢复至对照水平，TC仅在2O3cHdFP 300 ng/L + GW9662组仍显著高于对照，其余LCM + GW9662组TC无显著差异。qRT-PCR分析显示，除2O3cHdFP组外，其余暴露组pparg表达恢复至对照水平。尽管GW9662未完全消除肝脏损伤，但有效减轻了脂质蓄积，支持PPARγ相关信号参与LCMs诱导的肝脏脂质蓄积和NAFLD样肝脏表型。
四、讨论与结论
讨论部分指出，LCMs暴露可能通过干扰肝细胞分化或脂质转运而显著抑制斑马鱼幼鱼肝脏发育。转录组结果提示，LCMs暴露显著下调hnf1a（肝细胞核因子1α）和cebpa（CCAAT/增强子结合蛋白α）两个肝细胞成熟关键调控因子的表达，可能导致肝细胞停滞于未成熟阶段并伴随细胞空泡化。LCMs可能通过PPARγ相关脂质代谢信号改变诱导肝脏异常脂质沉积，分子对接提示LCMs可能作为PPARγ潜在配体与其相互作用，pparg异常表达可能影响脂质合成相关基因（如fasn和acc1）的转录调控，促进从头脂肪酸合成，cd36的差异表达进一步支持PPARγ相关脂质代谢反应的参与。救援实验中GW9662有效减轻脂质蓄积，为PPARγ相关信号参与LCMs相关肝脏脂质蓄积提供了功能性药理学支持，但GW9662未完全逆转2O3cHdFP诱导的脂质蓄积，提示其他调控通路也可能参与。此外，tFPO-CF2-dF3B组pik3r3a显著下调和mapk11/13同步上调提示胰岛素信号和炎症相关通路的独特转录响应，2O3cHdFB和TPrCB组mapk12a上调提示不同LCMs可能关联不同的MAPK相关转录响应。
LCMs暴露与斑马鱼幼鱼中显著的氧化应激响应相关，SOD、CAT和MDA显著升高表明氧化还原稳态被破坏。LCMs诱导的氧化应激伴随线粒体电子传递链（ETC）复合物相关基因的转录改变，四种LCMs对COX IV相关亚基诱导不同的转录改变，2O3cHdFP和TPrCB主要降低mtDNA编码亚基基因表达，tFPO-CF2-dF3B和2O3cHdFB主要影响核编码调控亚基，cox6a2（被2O3cHdFP、tFPO-CF2-dF3B和2O3cHdFB下调）参与细胞色素c氧化酶功能和线粒体氧化还原稳态，tFPO-CF2-dF3B和2O3cHdFB对COX I的额外抑制提示更广泛的线粒体呼吸过程扰动，这些转录改变可能与其较高的MDA水平相关。
LCMs暴露与斑马鱼幼鱼肝脏损伤和凋亡相关信号改变相关，ALT、AST和ALP显著升高支持肝脏损伤。线粒体功能相关改变可能促进O??生成，氧化应激进一步促进凋亡相关响应，bida、casp3b和casp7等凋亡相关基因的转录改变提示线粒体凋亡相关信号的参与，分子对接提示LCMs可能通过氢键和卤键与TNFR1相互作用，TNF和凋亡相关基因的转录改变提示外源性凋亡相关信号也可能参与LCMs诱导的肝脏损伤。
研究结论指出，环境相关浓度的氟化LCMs发育期暴露可损害斑马鱼幼鱼肝脏发育并诱导NAFLD样肝脏表型，表现为肝脏生长减少、异常脂质蓄积、肝损伤标志物升高、氧化应激响应以及脂质代谢和肝脏损伤相关转录改变。PPARγ拮抗剂GW9662的药理学干预进一步提示PPARγ相关脂质代谢紊乱参与LCMs诱导的肝毒性。这些发现拓展了对新型氟化LCMs污染物在早期生命阶段潜在健康风险的认识。该论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。
研究局限性包括：斑马鱼幼鱼模型不能完全再现人类NAFLD的复杂性，胰岛素抵抗、持续炎症和纤维化等NAFLD关键特征未被直接评估；部分分子通路主要基于转录组变化推断，需进一步功能验证；分子对接基于实验解析的人源受体结构而非斑马鱼同源结构，物种特异性结构差异不能排除；分子对接仅提供配体-受体潜在相互作用的理论预测，中等至较弱的预测结合能并不证明直接受体结合或激活；转录组分析基于幼鱼整体匀浆，观察到的转录变化可能反映组织特异性响应和不同组织器官相对比例的变化。未来研究需整合慢性暴露实验、组织特异性机制验证、多组学方法和流行病学证据，以完善LCMs的环境和健康风险评估。
