挖掘秀珍菇NRC 620漆酶同工酶在果汁加工中的潜力：纯化、动力学与生化表征

《Enzyme and Microbial Technology》：Unlocking the potential of Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase isoenzymes in juice processing: Purification, kinetics, and biochemical characterization

　　

摘要

本研究从蚝平菇 NRC 620中纯化并表征了两种漆酶同工酶——漆酶A（Lacc A）和漆酶B（Lacc B），并进一步评估了Lacc A在苹果汁处理中的应用。两种同工酶表现出不同的热稳定性特征：在120分钟后，Lacc B在40 °C和50 °C下分别保留了约92%和82%的活性，而Lacc A在30 °C下至少保留95%的活性，但在50 °C下60分钟内失去大部分活性，在60–70 °C下15分钟内即失活。pH稳定性分析显示两者呈互补模式：Lacc A表现出较强的耐酸性（pH 3.0时保留70%残留活性），Lacc B则表现出显著的耐碱性（pH 9.0时保留85–90%残留活性）。以ABTS为底物的动力学分析表明，Lacc A对底物具有更高的亲和力（K_m, 0.2728 mM）优于Lacc B（K_m, 0.7431 mM），而Lacc B的最大催化速率（V_max，0.3845 μmol·min^?1·mL^?1）高于Lacc A（0.1734 μmol·min^?1·mL^?1）。金属离子敏感性实验进一步区分了两种同工酶：Lacc A可被CuSO?（170%）、MgSO?和CoSO?激活，而Lacc B不受这些离子的影响，且被ZnSO?完全抑制。将纯化的Lacc A应用于苹果汁中引发了化合物特异性的酚类修饰；其中主要酚类化合物绿原酸仅略有减少，而没食子酸、咖啡酸、香草酸和儿茶素则大幅下降，其中几种在储存后变得无法检测。HPLC/GC分析鉴定出27种挥发性化合物，其中漆酶处理增强了关键的香气活性酯类，包括乙酸乙酯和乙酸乙基丁酸酯。感官评价证实，在两周冷藏储存期内产品质量可接受，支持了Lacc A作为苹果汁酶法加工生物催化剂的潜力。

引言

已知为多铜氧化酶的金属蛋白——即漆酶——能够氧化一系列酚类和非酚类物质。在底物氧化过程中，这些酶将底物的一电子氧化与分子氧的四电子还原为水的过程偶联[1]，[2]。漆酶是含铜多酚氧化酶（E.C. 1.10.3.2，p-二酚：氧氧化还原酶）。它们以其氧化各种芳香族和非芳香族物质的能力而著称[3]，[4]，[5]。这些有益特性使漆酶成为多种生物技术用途的可行生物催化剂，特别是在食品安全系统中的真菌毒素解毒和饮料澄清，以及用于分解持久性有机污染物的生物修复[6]。真菌漆酶通常由多基因家族编码，所产同工酶在等电点、糖基化、热稳定性和pH稳定性以及底物范围方面通常存在差异，这种差异正越来越多地被利用，以将特定同工型匹配到特定的生物技术用途，而非依赖单一的大宗酶制剂[7]，[8]。这在几种担子菌中已得到证实：三种雾花鬼伞同工型（Lac1–Lac3）尽管K_m相近，但在热稳定性和pH稳定性及染料脱色效率方面表现不同[9]；灵芝属同工酶（GlacL2–L5）经天然PAGE酶谱法纯化并通过MALDI-TOF确认，在温度和pH最适值及自由基清除行为方面存在差异[10]；而蚝平菇本身分泌多种同工型（如POXC、POXA1b、POXA3），具有不同的诱导性和生化特性[11]。

微生物、植物和昆虫均已被研究漆酶的来源。由于具有广泛的底物特异性和优异的催化效率，真菌漆酶长期以来已被描述[12]。已鉴定出许多来自子囊菌、半知菌和担子菌的真菌株，作为漆酶合成可靠的来源[13]。在这些物种中，白腐真菌表现出最大的胞外漆酶合成量，包括栓菌属、射脉侧耳、灵芝、黄孢原毛平革菌和平菇属等[12]。

漆酶在食品工业中的多种用途已被记录，包括果汁加工、烘焙和饮料加工。褐变是饮料中的主要质量问题，可通过漆酶减轻[14]。由于水果和蔬菜含有大量作为天然抗炎和抗氧化剂的维生素、矿物质和植物化学物质，它们被公认为对人类健康具有重要意义[15]。在众多水果中，苹果是第二重要的水果，在全球和欧盟范围内消费量都很高。2019年，全球苹果产量约为8700万吨[16]。大约25–30%的苹果被加工成各种产品，如果汁、浓缩汁、果酱、果泥和苹果酒，其余70%则作为鲜果食用。苹果中含有多种酚类化合物，包括咖啡酸和绿原酸等酚酸，以及黄烷醇和黄酮醇等类黄酮[17]。由于苹果汁常作为澄清果汁使用，过滤过程中50–90%的酚类化合物会丢失[18]。当今消费者选择轻度加工的产品，如高多酚含量的浑浊苹果汁。然而，由于其酚类含量高，这些产品极易发生褐变和色泽劣变[19]。

苹果果实及其产品中的挥发性化合物可分为几个化学类别，包括酯类、醛类、醇类、酮类和萜类[20]。苹果汁的香气主要由酯类和醛类决定，二者约占挥发性总成分的80–90%[21]。通过使用漆酶——一种在食品、纺织和制浆造纸行业具有多种应用的酶——可以增强或保持苹果汁的风味。已探讨了使用游离或固定化单酶处理，以及与超滤联用的方法来稳定苹果汁的色泽和浊度[22]。然而，关于真菌漆酶在储存过程中对苹果汁理化性质影响的信息仍十分有限。

我们课题组此前已报道了蚝平菇 NRC 620粗漆酶的生产及其初步应用，包括其伴随的水解副活性（α-淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶）以及将其作为未分级的粗制剂用于苹果汁处理[13]。该研究确立了该菌株作为有前景的漆酶来源，并提供了初步证据表明粗酶可改善果汁加工参数，但未将漆酶活性解析为其组成的同工酶，也未表征它们各自的生化特性。由于真菌漆酶常以多种同工酶的形式分泌，且这些同工酶在稳定性、金属离子敏感性和底物亲和力方面可能差异很大，仅有粗酶数据集不足以确定哪些组分驱动了观察到的处理效果，也不足以优化酶用于工业生产。本研究在此基础上直接推进，将粗漆酶纯化并通过色谱分离为两个不同的活性组分，分别命名为Lacc A和Lacc B，并独立表征了每个组分的生化特性，包括其最适温度和pH及稳定性、热灭活的热力学参数、对金属离子的敏感性以及米氏-门登动力学参数。此外，本研究利用纯化的酶制剂生成了新的苹果汁加工数据集，并结合HPLC和HS-SPME-GC-MS对酚类和挥发性化合物进行谱分析，以评估所分离的漆酶组分如何影响果汁品质，超越此前使用粗提取物评估的范围。

片段摘录

化学品与微生物

2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）购自Sigma公司（加拿大）。所用菌株购自加拿大国家研究委员会微生物化学部门菌种保藏中心。该菌株定期在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上传代培养，并于4 °C保存。

漆酶生产与酶活性测定

漆酶的生产方法参考本课题组先前研究报道[13]，使用蚝平菇 NRC 620生产漆酶。酶活性测定使用0.5 mL（0.3 mM）ABTS溶液于100 mM柠檬酸缓冲液中

NRC 620发酵液中漆酶的纯化

表1汇总了漆酶的纯化过程，其中粗滤液总活性为162.40 U，比活性为26.69 U/mg。硫酸铵沉淀（40–80%饱和度）后比活性达到30.50 U/mg（提高1.14倍；回收率95.5%），Sephadex G-100凝胶过滤后达到48.25 U/mg（提高1.81倍；回收率89.4%）。DEAE-Sephadex A-50离子交换层析分离出三个活性峰。第一个峰（P1，命名为Lacc A）比活性达到144.14 U/mg（提高5.40倍；回收率8.74%），第二个

结论

两种蚝平菇 NRC 620漆酶同工酶（Lacc A和Lacc B）的最适催化温度与其他真菌来源的漆酶相比均较高。Lacc A虽然热稳定性较差，但在30 °C下120分钟内仍保留了约95%的活性，适合环境温度下的应用。Lacc A表现出优越的耐酸性，在pH 3.0时120分钟后保留了约70%的活性。Lacc B表现出显著的耐碱性，保留了85–90%的活性。

作者贡献

所有作者共同完成了研究的概念化、规划和数据评估。实验由A.M.O.、N.M.S.、G.E.I.和M.A.E.执行。项目由A.M.E.、M.A.E.、N.S.M.和M.M.H.指导监督。初稿由A.M.O.、M.A.E.和G.E.I.撰写。本文经所有作者审阅并批准。

CRediT作者贡献声明

Abdelmageed M. Othman：写作—审阅与编辑、写作—初稿撰写、可视化、验证、方法论、调查研究、形式分析、数据整理、概念化。Nashwa M. Shalapy：写作—初稿撰写、验证、方法论、调查研究、数据整理。Gamil E. Ibrahim：写作—初稿撰写、验证、方法论、调查研究、形式分析、数据整理、概念化。Maysa A. Elsayed：写作—初稿撰写、验证、方法论，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者谨向埃及国家研究中心致谢，该中心在研究项目编号13020111下为本次调查提供了资金支持。

Abdelmageed M. Othman | Nashwa M. Shalapy | Gamil E. Ibrahim | Maysa A. Elsayed | Nayra S. Mehanna | Mohamed M. Hassan | Ali M. Elshafei

埃及吉萨省多基区33号巴拉夫斯路，国家研究中心生物技术研究所微生物化学部门，邮编12622