亚油酸异构酶的半理性工程改造提高了共轭亚油酸生物合成的催化效率与底物亲和力

《Enzyme and Microbial Technology》：Semi-rational engineering of linoleic acid isomerase improves catalytic efficiency and substrate affinity for conjugated linoleic acid biosynthesis

　　

摘要

共轭亚油酸（CLA）是食品与医药工业中重要的功能化合物，其生物合成依赖于亚油酸异构酶（LAI）。然而，天然LAI的催化效率和底物亲和力较低，限制了CLA的合成及其工业应用。为克服这一局限，本研究采用半理性工程策略对痤疮丙酸杆菌（P. acnes）来源的LAI进行改造，以P229为母本菌株，构建了可溶性单酶体系。通过重叠延伸PCR筛选并实验验证了5个具有潜力的突变位点（G36R、G7Q、Y319W、E392R、F399W）。与野生型P229（WT）相比，pCold-lai-pG36R变异的基因表达量提高了4.56倍，酶活性提高了1.95倍。结构分析表明，G36R突变引入了盐桥和更短的氢键。纯化的突变体在20–40 ℃及pH 7–8范围内仍能保持超过60%的CLA产量，在30 ℃、pH 7.0时活性最优（Vmax = 21.41 μg·mL?1·h?1，Km = 0.22 mg·mL?1）。本研究结果突显了半理性工程提升LAI性能的潜力，为工业化应用提供了有价值的参考。

引言

共轭亚油酸（CLA）是亚油酸（LA）的位置和几何异构体，分子中含有18个碳原子和两个共轭双键。其主要异构体为顺-9，反-11-CLA（c9, t11-CLA）和反-10，顺-12-CLA（t10, c12-CLA）异构体[1]，[2]。CLA被广泛用于功能性食品、膳食补充剂和食品添加剂[3]，具有抗氧化[4]、免疫调节[5]、抗癌[6]、抗动脉粥样硬化[7]、减脂[8]及抗炎[9]等多种生物活性。其天然来源包括反刍动物肉类[10]和乳制品[11]。

CLA可通过化学或生物途径合成。化学合成成本低、速度快，适合大规模生产，但会产生异构体混合物，若需要特定异构体则需额外纯化[12]。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）已将CLA列为"通常被认为是安全的"（GRAS）物质[8]，但生物合成法因其选择性强、反应条件温和且分离纯化步骤相对简单[14]，[15]，而越来越多地被采用。该方法利用亚油酸异构酶（LAI）或表达LAI的微生物进行催化[13]。然而，微生物法面临酶活性低和表达量低等细胞内限制，导致催化不足[15]。因此，提高LAI的底物亲和力、催化效率和可溶性表达水平是实现CLA高效生物合成的关键。例如，来自乳杆菌属（Lactobacillus reuteri）、纤维溶纤维菌属（Butyrivibrio fibrisolvens）、产芽孢梭菌属（Clostridium sporogenes）[16]及短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）[17]等物种的膜结合型LAI酶难以提取，这在重组表达系统（如痤疮丙酸杆菌P. acnes）中形成瓶颈[1]。因此，协同提高酶活性和可溶性表达水平至关重要。

基因工程与生物工艺工程的进步显著优化了LAI的酶学性质。例如，Li等[18]在BL21（DE3）中实现了密码子优化的重组LAI异源表达，在35 ℃、pH 7.0下获得了752.3 μmol·min?1·mg?1的活性。类似地，麦芽糖结合蛋白（MBP）与pColdV系统的融合技术使比活提高至1.58 U·mg?1[19]，而启动子与融合标签的组合则改善了动力学效率，Km = 253.9 μmol·L?1，Vmax = 2253 nmol·min?1·mg?1[1]。此外，You等[20]将LAI固定于改性海泡石上，在温和条件下增强了活性，并在七次重复使用后仍保持功能。这些从基因工程、融合技术到固定化的进展，为LAI的进一步发展提供了可行的技术路径。

为实现成本高效的CLA生物合成，需要具有改善活性、纯度和稳定性的LAI变体。当前的酶工程方法包括定向进化、理性设计和半理性设计，后者结合了前两者的优势。定向进化无需详细的酶结构知识即可生成突变体，但因高通量筛选需求而资源消耗大[21]，[22]。例如，Huang Liang等[23]利用易错PCR和DNA Shuffle对嗜酸乳杆菌AS1.1854的亚油酸异构酶进行进化，获得了活性为8.2 U的重组酶。相比之下，理性设计基于已知结构对关键残基进行定向改造，效率更高，但要求[24]酶结构特征明确[25]，[26]，[27]。

半理性设计在亚油酸异构酶的工程改造中具有独特适用性。目前，痤疮丙酸杆菌（PAI）的亚油酸异构酶晶体结构已解析（PDB ID: 2BAB）[28]。然而，其他物种酶的三维结构尚未通过实验确定，其功能研究目前依赖通过计算模拟构建的预测模型。半理性设计通过利用序列和结构数据识别保守残基和关键位点，将突变聚焦于底物结合口袋或催化区域[29]，[30]，[31]，[32]，从而在这些区域进行靶向饱和突变，生成规模较小但质量较高的突变体文库，减少了随机突变，提高了筛选效率[24]，[33]。例如，对于结构未知的膜结合型亚油酸异构酶BBI，研究人员采用蛋白质结构模拟和不同底物的分子对接，预测了酶活性中心的氨基酸残基。随后的突变鉴定出Y205为关键残基，Y205M突变体使BBI的相对酶活提高至111%[34]。该策略结合了定向进化和理性设计的优势[29]，为活性和稳定性提升提供了一条相对简便且快速的途径[35]。因此，该方法同样适用于本研究中对结构未知的LAI突变体进行工程改造。

随着对LAI结构和功能研究的逐步深入，Zhao等[36]通过多序列比对阐明了植物乳杆菌（L. plantarum）p-8的LAI四个亚基的空间结构和催化元素，而Liavonchanka等[37]基于痤疮丙酸杆菌PAI的晶体结构确定了活性位点，并提出了基于结构的聚不饱和脂肪酸异构化机制。研究人员利用上述结构信息对LAI进行分子改造。Jia等[38]对植物乳杆菌L. plantarum LAI P-8的预测活性位点进行定点突变，获得了酶活性增强的R107L-LAI突变体。Ji等[34]通过半理性设计获得了Y205M突变体，其相对活性提高至111%。在后续研究中，该课题组利用虚拟丙氨酸扫描鉴定出关键残基Lys84、Tyr198、Leu245和Asn202[39]，[40]。然而，大多数研究仅止步于突变体活性的测定，缺乏对突变后构象变化及底物结合模式改变的深入分析。具体而言，突变如何影响LAI的空间构象、底物进入通道、活性中心残基排列以及酶与LA之间的结合亲和力等关键问题仍有待系统阐明。引入突变后分子对接分析不仅能阐明酶-底物相互作用及酶活性增强的机制（即结构-功能关系），还能为后续LAI活性和稳定性的优化以及工业应用提供实验依据和技术参考。

本研究采用半理性设计对LAI进行工程改造，以高活性P229突变体为起点进行定向进化。利用Discovery Studio 4.5构建LAI三维结构模型，进行分子对接和虚拟饱和突变以识别底物结合残基，并通过重叠延伸PCR引入靶向突变（图1）。对纯化的突变体酶进行表征，并通过底物对接分析结构-功能关系。这些发现为优化LAI性质以满足工业生产需求提供了关键见解。

材料与方法

菌株、质粒与培养条件

由本课题组前期构建的携带lai-p基因的P229菌株，划线接种于含100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB平板上。观察菌落形态后，挑取单菌落接种于含Amp的20 mL LB培养基中，37 ℃、160 rpm振荡培养12 h。使用质粒提取试剂盒（Aidlab，北京，中国）提取质粒。利用表S1所示引物通过PCR扩增lai-p基因片段。质粒构建采用pMD18-T载体（TaKaRa Bio...）

LAI模型构建与评估

由于无法获取P229菌株LAI的精确晶体结构，我们利用DS软件的同源建模方法构建了其三维结构。模板识别和序列比对基于其氨基酸序列进行。模板选择对模型质量至关重要，序列同源性（>30%）和E值（E < 1e-5）作为可靠性指标予以考量。模板2b9w_A表现出最高的序列同源性（97%）和最低的E值（表1，图2A），因此被选为...

讨论

本研究采用结合计算模拟与实验验证的半理性设计方法，鉴定出LAI突变体pCold-lai-pG36R，该突变体表现出显著改善的底物亲和力和酶活性。整合人工智能驱动的蛋白质结构预测与分子对接技术，在揭示酶-底物相互作用方面证明有效[44]。本研究采用同源建模构建突变亚油酸的三维结构...

结论

本研究采用半理性工程策略开发了LAI突变体pCold-lai-pG36R。该突变体的比活为3.07 U·μg?1，是野生型的1.95倍，基因表达量提高了4.56倍。动力学参数（Vmax = 21.41 μg·mL?1·h?1，Km = 0.22 mg·mL?1）证实了其改善的底物亲和力和酶活性，突显了该突变体在CLA生物合成中的工业应用潜力。本研究未能区分...

作者贡献

Yao Kailin与Lin Xinpeng对本研究贡献相等：撰写原始稿件、验证、方法论、调查、形式分析；Chen Yeping：方法论、调查、形式分析；Zhang Shuang：撰写—审阅与编辑；Chen Yimeng与Wang Jianing：验证；Shao Junhua：项目管理；Luo Xue：方法论、资金获取、可视化。

CRediT作者贡献声明

Yao Kailin：撰写—原始稿件、验证、方法论、调查、形式分析。Lin Xinpeng：撰写—原始稿件、验证、方法论、调查、形式分析。Chen Yeping：方法论、调查、形式分析。Zhang Shuang：撰写—审阅与编辑。Chen Yimeng：验证。Wang Jianing：验证。Shao Junhua：项目管理。Luo Xue：方法论。

资金支持

本研究得到辽宁省科技计划联合基金项目（项目编号：2024011852-JH4/4800）和中国国家重点研发计划（项目编号：2025YFF1107701）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

不适用。

Kailin Yao | Xinpeng Lin | Yeping Chen | Shuang Zhang | Yimeng Chen | Jianing Wang | Junhua Shao | Xue Luo
沈阳农业大学食品科学学院，沈阳，110866，中国