基于离体方法可视化比目鱼（Paralichthys olivaceus）硬骨鱼黏液屏障的三维形态结构与动态防御特性

《Fish & Shellfish Immunology》：Visualizing the 3D morphological structure and dynamic defensive characteristics of teleost mucus barrier through an ex vivo approach in flounder ( Paralichthys olivaceus)

　　

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  离体系统实现了完整鱼黏液屏障的三维可视化。
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  鳃、后肠和皮肤黏液层呈现不同的组织特异性结构。
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  黏液屏障作为粒径依赖的物理筛网对颗粒发挥作用。
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  颗粒穿透和滞留情况随颗粒类型和组织来源而异。
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  黏液屏障通过层状隆起和团块脱落清除颗粒。

引言

鱼类养殖业长期受疾病困扰，造成重大经济损失 [1]、[2]。大多数病原体通过侵入鱼类的黏膜表面（如鳃、肠道和皮肤）来引发感染 [3]、[4]。这些组织直接暴露于水生环境，承受着悬浮颗粒的持续物理磨损、溶解物质的化学刺激以及致病微生物的直接附着和入侵 [3]、[4]、[5]、[6]。覆盖在这些表面上的黏液层构成了鱼类与其环境之间的重要生理界面。它作为抵御感染的第一道防线，对于渗透调节、繁殖行为和化学通讯也至关重要 [4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。该黏液层由黏蛋白、免疫球蛋白、抗菌肽、溶菌酶及其他生物活性分子组成 [8]、[10]。黏蛋白是一种高度糖基化的、高分子量糖蛋白，由杯状细胞（即黏液细胞）合成和分泌，构成黏液层的结构核心 [8]、[10]、[11]。通过组装成水合凝胶网络，黏蛋白赋予黏液层关键的理化特性，如黏弹性、润滑性和选择性渗透性 [12]。在养殖业中，异常的黏液状态，例如过度分泌、黏度和渗透性改变、黏蛋白糖基化改变或过早脱落，通常是鱼类病原感染、寄生虫侵害或环境压力的早期视觉指标 [7]、[9]。因此，全面研究黏液层的生物学特征已成为理解和保障鱼类健康与福利的关键研究前沿。

关于黏液细胞和黏液屏障的研究在哺乳动物中已相对成熟。研究表明，黏液层主要由凝胶形成型黏蛋白组成，如胃肠道中的MUC2和呼吸道中的MUC5AC/MUC5B [11]、[13]、[14]，它们通过分子内和分子间二硫键形成三维（3D）水合凝胶网络 [15]。黏蛋白上的糖链创造了一个富含负电荷和特定化学成分（如唾液酸）的微环境。一些共生细菌可以将这些糖链作为碳源进行代谢，产生短链脂肪酸等代谢物 [9]、[13]。值得注意的是，在健康小鼠中，结肠黏液层呈现双层结构：一层是紧贴上皮表面的无菌致密内层，另一层是嵌有大量肠道微生物的疏松外层。两层均由MUC2聚合形成，其分化源于MUC2分泌后的差异水化和结构重组 [16]。MUC2基因敲除小鼠无法形成该结构，导致细菌侵入上皮并自发引发严重结肠炎，直接证明了该黏液层在维持肠道稳态中的基本屏障功能 [16]、[17]。相比之下，关于鱼类黏液系统的认知仍然不足。当前的研究方法主要包括糖染色，如凝集素、阿利新蓝（AB）和阿利新蓝-过碘酸-Schiff（AB-PAS），以及基因表达定量和液相色谱-质谱（LC-MS）进行糖组学分析 [19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。例如，凝集素染色和LC-MS已被用于表征感染阿米巴鳃病的三文鱼（Salmo salar）鳃部黏蛋白O-糖基化变化 [23]，以及脂多糖刺激后虹鳟（Oncorhynchus mykiss）胃肠道内的变化 [24]。在此前的工作中，我们鉴定并生成了针对星斑川鲽（Paralichthys olivaceus）中Muc2和Muc5ac的特异性抗体，从而阐明了它们在蛋白质水平上的组织特异性分布 [25]。进一步的调查显示，用灭活爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）进行浸洗免疫可同步诱导这些黏蛋白表达和分泌的上调，促进黏液细胞增殖，并延长抗原在黏液层内的滞留时间 [25]。然而，关于鱼类黏液层基本形态和结构的系统性描述和共识仍然缺乏。有关其整体空间架构（如厚度和均一性）以及是否存在功能性或理化分区（如分层结构）的基本问题，仍待通过高分辨率成像技术加以阐明。

黏液层是一个通过持续分泌和脱落实现自我更新的动态系统。经典技术如灌注槽-炭颗粒法，通过测量离体肠黏液表面颗粒的位移来定量评估黏液厚度、生长速率和屏障功能 [16]、[26]、[27]、[28]。为了观察动态的黏液层，已在哺乳动物模型中开发了多维方法。在体内应用方面，高分辨率染色内镜和基于探头的共聚焦激光内镜可实现黏膜表面结构的原位和重复观察，允许对病理变化进行纵向追踪 [16]、[29]、[30]。其中，双光子激光扫描显微镜通常采用浆膜面进路，对肠黏膜屏障层进行高倍三维断层扫描和动态视频记录，实现了活体小鼠黏液层结构和细胞活动的高分辨率、三维、动态观察 [31]、[32]、[33]。这些方法的演进明确指向了对黏液层进行更加原位、整体和动态分析的技术需求。然而，鱼类等水生动物与哺乳动物在基本解剖和环境方面的差异阻碍了现有技术方案的直接迁移。由于鱼类黏液层含水量高、流变特性强且具有透明性，其自然状态下的精细结构难以在原位环境中清晰可视化，构成重大研究障碍 [24]。常规组织切片依赖于多步孵育和洗涤过程，在此期间常用的固定液通常会导致黏液层脱水、结构塌陷甚至完全丧失。虽然卡诺固定液能更好地保存黏液形态，但它仅提供二维横截面信息 [34]、[35]。在三文鱼和虹鳟中，已使用林格液对新鲜解剖的活体组织进行离体黏液成像 [23]、[24]。然而，迫切需要一种离体组织培养系统，能够无损地、原位分析黏液层的动态三维结构，并评估病原体与黏液屏障之间的动态相互作用。

本研究以星斑川鲽（P. olivaceus）为模型，该物种是中国、日本和韩国的一个重要经济海洋鱼类，也是鱼类免疫学研究的重要参考物种 [25]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]，利用激光扫描共聚焦显微镜（LSM）建立了用于动态黏液层观察的离体培养组织观察方案。该方案有效保存了黏液层的天然状态，操作简单且结果可重复。基于该方案的多模态分析揭示了星斑川鲽鳃、后肠和皮肤黏液屏障的三维结构架构。此外，本研究还调查了黏液层对不同粒径颗粒的差异渗透性，并在微观尺度上刻画了其物理筛网状微结构。通过离体模拟外部挑战，包括灭活E. tarda疫苗浸洗、活体E. tarda感染以及1 μm荧光微球（FMBs），本研究动态追踪了黏液介导的外来颗粒捕获、包封和清除过程，以及部分颗粒穿越黏液屏障的转运过程。本工作为更直观地理解鱼类黏液层的屏障功能以维持黏膜稳态奠定了方法和理论基础。

章节摘要

动物与伦理声明

从山东省青岛市的一家商业养殖基地购买体长为15 ± 2 cm、体重为54 ± 5 g的健康星斑川鲽。实验前，鱼在循环水养殖系统中适应7天，水温保持在20 ± 1 °C。适应期间，每天以体重的1%饲喂商业饲料，并通过采样监测其健康状况

离体组织培养系统和细胞活力分析

如图1所示，建立了离体组织培养系统，实现了对星斑川鲽鳃、后肠和皮肤组织黏液层三维结构和动态变化的原位观察。为验证该系统对后续实验的可行性，使用Calcein AM/PI细胞活力检测试剂盒评估了在RPMI Medium 1640中培养的鳃、后肠和皮肤的活力，并通过LSM对样本进行成像和分析。在初始时间点（0小时），大量的

讨论

鱼类黏液屏障是抵御病原体入侵的第一道防线，其完整性直接影响鱼类的健康状况，是水产养殖中评估鱼类健康的关键指标 [7]、[45]、[46]。近年来，越来越多的关注集中在黏液屏障的组成、功能及其在黏膜免疫中的作用上。与哺乳动物研究相比，鱼类黏液研究起步相对较晚，主要关注于

未引用参考文献

[18]。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经中国海洋大学动物护理和使用委员会批准。（批准号：OUC-AE2022-071）

数据可用性

数据可按请求提供。

作者声明

Jincheng Wang：验证、正式分析、调查研究、原创草稿撰写、可视化、数据整理。Ziyi Zhang：验证、正式分析、调查研究、原创草稿撰写、数据整理。Yanrui Xu：验证、调查研究。Xiuzhen Sheng：概念化、方法论、论文审阅和编辑、项目管理；资金获取。Ningge Zhang：正式分析。Xiaoqian Tang：方法论、资源。Jing Xing：方法论，

利益冲突声明

作者声明，本研究是在不存在任何可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（批准号：<--><->32273163<--><->）国家重点研发计划（<->2024YFD2400102<->）以及崂山实验室的支持。

Jincheng Wang|Ziyi Zhang|Yanrui Xu|Xiuzhen Sheng|Ningge Zhang|Xiaoqian Tang|Jing Xing|Heng Chi|Wenbin Zhan