整合计算机模拟（in silico）与体外（in vitro）新方法学（NAMs）评估咖啡因相关化合物methylliberine和theacrine的代谢、血脑屏障通透性及A2A受体/CYP1A2相互作用

《Food and Chemical Toxicology》：Evaluating the biological effects of caffeine-related compounds methylliberine and theacrine by integrated in silico and in vitro new approach methods (NAMs)

　　

研究人员通过整合的计算机模拟（in silico）和体外（in vitro）新方法学（new approach methods，NAMs）评估咖啡因相关化合物methylliberine和theacrine的生物学效应。methylliberine和theacrine均通过计算机模拟和体外NAMs进行了评估。两种化合物均被预测经去甲基化（desmethylation）代谢，与咖啡因相似。两种化合物均被预测可透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），与咖啡因相似。methylliberine及其代谢物1,2,9-MU被鉴定为CYP1A2抑制剂。两者均作为A_2A受体拮抗剂，但弱于咖啡因。

论文解读：

研究背景与立题依据：嘌呤生物碱（purine alkaloids）是100多种植物产生的次生代谢物，广泛存在于咖啡、茶、马黛茶、可乐果、瓜拉那、cupua?u和可可等常见食品和饮料中。该类化合物可按结构分为甲基黄嘌呤（methylxanthines，MXs）和甲基尿酸（methyluric acids，MUs），二者差异在于羰基，且甲基数目和位置不同。MXs包括咖啡因（1,3,7-MX）、茶碱（1,3-MX）、可可碱（3,7-MX）和副黄嘌呤（1,7-MX）。许多MXs可透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），通过拮抗腺苷A₁和A_2A受体产生刺激作用；较高剂量下，腺苷受体相互作用可导致神经、胃肠和心血管系统不良效应。除腺苷受体外，3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）可抑制磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）并导致心血管不良效应，furafylline可抑制细胞色素P450 1A2（cytochrome P450 1A2，CYP1A2）活性，影响外源物代谢并导致药物相互作用。相较MXs，MUs研究较少。两种突出的MUs为theacrine（1,3,7,9-tetramethyluric acid；1,3,7,9-MU）和methylliberine（1,2,7,9-MU）。多数植物中MUs水平低于MXs，但theacrine在Camellia assamica var. kucha中可达约2%重量。除天然存在外，theacrine和methylliberine越来越多用于膳食补充剂。NIH Dietary Supplement Label Database显示，356种市售产品含methylliberine、theacrine或二者，每份10至250 mg，标签常涉及“pre-workout”“weight loss”“energy focus”和“extreme energy”。尽管二者与咖啡因结构相似，微小结构差异也可导致生物效应显著改变，因此需要毒理学测试。由于体内测试限制，in silico和in vitro NAMs可作为低成本、快速工具填补安全数据缺口。识别化合物与安全相关生物靶点相互作用，可广泛识别多种不良健康效应；将生物靶点数据与互补NAMs结合可提高生理相关性。对methylliberine和theacrine而言，理解BBB通透性和代谢尤其重要，因为这些因素参与咖啡因及其代谢物的人体健康效应。因此，研究人员采用多种NAMs，包括in silico模型和in vitro试验，分析其代谢物、BBB通透性及与安全相关生物靶点相互作用，并与咖啡因及其代谢物比较，以识别潜在人体健康效应。

关键技术方法：研究人员采用四种in silico定量构效关系（(quantitative) structure-activity relationship，(Q)SAR）模型预测methylliberine和theacrine代谢物；采用Percepta、ADMET Predictor、admetSAR3.0和ADMET-AI预测BBB通透性相关参数，并以k-means聚类和主成分分析（principal component analysis，PCA）分析。通过DrugBank结构相似性筛选和Off-X数据库选择安全相关靶点。体外采用竞争性放射配体结合测定A₁和A_2A受体，P450-Glo法测CYP1A2抑制，Transcreener AMP2/GMP2 FP法测PDE3A、PDE4B、PDE4D抑制，LANCE Ultra cAMP法测A_2A功能活性。初筛浓度为100 μM，抑制率大于67%者进入浓度反应试验，并以Prism 10拟合半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）和半数效应浓度（half-maximal effect concentration，EC₅₀）。研究未涉及人类样本队列，使用商业重组人受体或酶以及稳定表达人重组A_2A受体的HEK-293细胞。

研究结果：

3.1 代谢物预测（Metabolite predictions）：四种计算模型预测methylliberine和theacrine代谢物。methylliberine预测得到18个独特代谢物，theacrine预测得到20个独特代谢物。二者最常预测的生物转化为N-去甲基化。methylliberine还预测有O-去甲基化和N-氧化，因其含未取代或未质子化氮以及甲氧基。SyGMa和Meteor Nexus预测代谢物最多，CTS最少，因CTS仅预测两代生物转化。模型一致预测一或两个N-去甲基化产物，如methylliberine的1,2,7-MU、1,2,9-MU、2,7,9-MU和2,7-MU，以及theacrine的9-MU、3,9-MU等。低分且仅一个模型预测的代谢物对应O-去甲基化、N-氧化、脂肪族C-氧化或环氧化。咖啡因临床代谢物主要经连续N-去甲基化，并独特地经C-氧化形成MUs；MUs因已含羰基不能再发生该转化。后续研究选择单去甲基化代谢物，因其预测分数高且四模型一致，同时纳入二去甲基化和三去甲基化代谢物以评估构效关系。

3.2 血脑屏障通透性预测（BBB permeability predictions）：研究人员评估methylliberine、theacrine、咖啡因及其去甲基化代谢物的BBB通透性。预测五个参数，包括log[PS×f_{u, brain}]、两个模型的logBB和两个模型的BBB通透性评分。k-means聚类和PCA显示，前两个主成分解释89%方差，最佳聚类数为2。一个簇含三或四甲基的MXs和MUs，包括methylliberine、theacrine及部分三甲基尿酸代谢物如1,3,9-MU，并包含已知穿BBB的咖啡因、可可碱、茶碱和副黄嘌呤。另一个簇含一甲基MXs如7-MX，以及一或二甲基MUs如2-MU和1,9-MU。结果表明，连续N-去甲基化降低疏水性和BBB通透性。

3.3 生物靶点选择（Biological target selection）：研究人员通过DrugBank筛选结构类似物，条件为结构相似性大于0.800、分子量150至300且具有人类生物靶点注释，鉴定出咖啡因、茶碱、可可碱、8-溴茶碱、8-氯茶碱和IBMX。根据安全相关生物靶点的频率和相关性，选择腺苷受体A₁和A_2A、CYP1A2以及PDE3A、PDE4B、PDE4D进行体外测试。Off-X数据库显示，这些靶点抑制涉及心脏、神经、精神、胃肠、血管和一般疾病等系统器官类别。例如，A₁和A_2A受体抑制与血压升高、血管舒张、高血压、激动和失眠相关；CYP1A2抑制剂可干扰外源物代谢并导致药物相互作用；PDE3抑制可能导致低血压、心动过速和心律失常；PDE4抑制可能导致头痛、恶心和呕吐。

3.4 受体结合和酶抑制的生物靶点试验（Biological target assays for receptor binding and enzyme inhibition）：研究人员测试methylliberine、theacrine、咖啡因及所有可商购去甲基化代谢物对A₁、A_2A受体结合和CYP1A2、PDE3A、PDE4B、PDE4D酶活性的抑制。初筛100 μM后，抑制率大于67%的化合物进入浓度反应试验并计算IC₅₀。对A₁和A_2A受体，咖啡因、茶碱和副黄嘌呤等MXs相对较强，IC₅₀为5.5至46.7 μM；MUs因羰基显著减弱与A₁和A_2A受体结合。MXs中A_2A受体最强抑制剂含N1-甲基化。多数MUs对A₁和A_2A受体为弱抑制，IC₅₀大于100 μM，但1,2,9-MU和1,3,7-MU的IC₅₀为50至100 μM。对CYP1A2，仅methylliberine（IC₅₀为9.6±3.1 μM）及其代谢物1,2,9-MU（IC₅₀为27.2±8.4 μM）相对较强，其余化合物IC₅₀大于200 μM；二者共有2-甲氧基，独特影响CYP1A2抑制。对PDEs，几乎所有化合物对PDE3A、PDE4B和PDE4D抑制均弱，仅7-MX对PDE3A有中等抑制，IC₅₀为50至100 μM；阳性对照IBMX对全部PDEs相对强抑制，IC₅₀为10.2至23.0 μM。

3.5 A_2A受体功能活性试验（A_2A receptor assay for functional activity）：研究人员通过基于cAMP浓度变化的细胞试验测定A_2A受体激动和拮抗活性。methylliberine、theacrine、咖啡因、茶碱和副黄嘌呤在1至100 μM范围内测试。除对照激动剂NECA（EC₅₀为1.0±0.6 nM）外，测试化合物均无激动活性。methylliberine和theacrine显示拮抗活性，100 μM时分别抑制A_2A受体61.8%和51.8%；茶碱、副黄嘌呤和咖啡因在100 μM时抑制100%。茶碱（IC₅₀为4.9±1.6 μM）、副黄嘌呤（IC₅₀为23.3±11.3 μM）和咖啡因（IC₅₀为17.0±2.1 μM）为更强A_2A受体拮抗剂。对照拮抗剂ZM 241385在纳摩尔范围强抑制，IC₅₀为12±4 nM。

讨论部分总结：本研究采用互补NAMs组合分析methylliberine和theacrine，考虑代谢、BBB通透性和与不良健康效应相关生物靶点的相互作用。这些终点基于结构相关嘌呤生物碱如咖啡因等的已知效应选择。整合NAMs数据和聚类分析提供更整体的机制见解，并与咖啡因比较以语境化潜在人体健康效应。多个独立in silico QSAR模型预测代谢物和BBB通透性可增加预测信心；无监督机器学习方法包括层次聚类、PCA和k-means聚类，有助于分析多变量数据并识别构效关系，特别是甲基和羰基对代谢和BBB通透性的影响。BBB通透性对中枢神经系统效应重要，聚类提示连续N-去甲基化降低疏水性和BBB通透性。theacrine、methylliberine及其三甲基化代谢物与已知穿BBB化合物聚在一起。尚无methylliberine或theacrine的体内或体外BBB通透性测量，但啮齿动物研究提示theacrine因脑神经递质变化可透过BBB；啮齿动物研究也发现1-MU和1,3-MU不透过BBB，与本研究中单甲基和二甲基尿酸单独聚类一致。CYP1A2方面，methylliberine及其代谢物1,2,9-MU相对强抑制CYP1A2。CYP1A2代谢大量外源物，包括咖啡因和约9%临床药物；抑制剂可降低底物药清除并导致临床显著相互作用。临床研究显示，口服methylliberine 50至125 mg的C_max为1至14 μM，与体外CYP1A2 IC₅₀重叠；与咖啡因共同给药可增加咖啡因血浆浓度，确认体内相互作用。theacrine口服50至125 mg的C_max为1至14 μM，低于其CYP1A2抑制效力9倍以上，提示该相互作用不具生理相关性；临床共给theacrine和咖啡因未改变咖啡因浓度。A_2A受体是中枢神经系统重要靶点，腺苷作为激动剂调节睡眠和抑制炎症，拮抗剂可阻断腺苷信号并产生心血管和神经刺激效应。本研究中methylliberine和theacrine均为A_2A受体拮抗剂，但弱于咖啡因和二甲基黄嘌呤。其临床C_max为1至14 μM，数倍低于估计IC₅₀ 100 μM，较咖啡因及代谢物有更宽margin；高剂量时margin可能缩小。临床研究中theacrine 420 mg可导致心动过速、血压升高和其他不良效应，可能与C_max增加及A_2A受体效力margin缩小有关；较低剂量100至400 mg研究未报告或未观察到A_2A拮抗相关生理效应。混合物累加效应也需关注：methylliberine、theacrine和咖啡因常共同存在于消费品中，三者均为A_2A受体拮抗剂，混合物可导致累加A_2A受体拮抗，产生单独低剂量不出现的神经和心血管效应。代谢物也可能贡献累加效应。theacrine和咖啡因共享代谢物1,3,7-MU，该代谢物预测可透过BBB并具有A_2A受体结合，估计IC₅₀为50至100 μM；高剂量同服时二者均可代谢为1,3,7-MU，可能贡献累加A_2A受体效应。未来需更全面的混合物A_2A受体拮抗体外测试、混合物相关模型分析和药代动力学分析。

研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员使用一套NAMs分析methylliberine和theacrine，这两种嘌呤生物碱存在于食品和作为膳食补充剂销售的产品中。具体而言，NAMs预测了代谢物、预测了BBB通透性，并测量了化合物与安全相关生物靶点之间的相互作用。多个in silico模型预测methylliberine和theacrine产生去甲基化代谢物，与咖啡因相似的代谢途径。此外，methylliberine、theacrine及其三甲基化代谢物被预测可透过BBB，这与咖啡因及其二甲基化代谢物类似。体外生物靶点试验鉴定methylliberine及其三甲基化代谢物在生理相关浓度下为CYP1A2抑制剂。最后，methylliberine和theacrine在体外为腺苷A_2A受体拮抗剂，提示潜在刺激效应，尽管这两种化合物比甲基黄嘌呤咖啡因、副黄嘌呤和茶碱弱数倍。总体而言，用一套NAMs分析methylliberine和theacrine，并结合与咖啡因的相对比较，为膳食补充剂产品中两种突出物质的潜在人体健康效应提供了综合评估。