底栖硅藻Amphora sp. WCA23.2来源的β-葡聚糖富集多糖提取物在离体心脏组织裂解液模型中缓解氧化应激反应的研究

《Food Chemistry Advances》：β-Glucan-enriched polysaccharide extract from the benthic diatom Amphora sp. WCA23.2 attenuates oxidative responses in an ex-vivo cardiac tissue lysate model

　　

β-葡聚糖是一类结构多样的多糖，具有报道的抗氧化和心血管代谢活性，但微藻葡聚糖制剂的相关研究仍相对不足。本研究调查了从底栖硅藻Amphora sp. WCA23.2中分离的一种β-葡聚糖富集多糖组分，并在一个利用大鼠心脏组织裂解液的离体硫酸亚铁（FeSO4）诱导氧化应激模型中评估了其效果。该组分相对于干生物量的β-葡聚糖含量为8.97%，水解后主要检测到的单糖包括葡萄糖（50%）、鼠李糖（28%）和甘露糖（22%）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示了特征性的碳水化合物吸收带，其中包括一个位于889 cm-1附近的吸收带，与β-异头构型一致。然而，这些数据并不能确定其为均一的β-(1→3)-葡聚糖，也无法定义其分子量或键合分布；因此，该材料被描述为一种β-葡聚糖富集的多糖提取物。FeSO4处理诱导了心脏裂解液中的氧化改变，包括脂质过氧化增加和抗氧化酶活性改变。用该提取物（30–240 μg/mL）处理后，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性升高，丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）水平降低，而还原型谷胱甘肽（GSH）无显著变化。该提取物还调节了血管紧张素转换酶（ACE）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、ATP酶（ATPase）、ENTPDase和脂肪酶的活性，并在氧化胁迫后部分恢复了心脏脂质谱。气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析进一步表明，处理组相关的脂质代谢物和代谢通路发生了改变。总体而言，该Amphora来源的组分在一个离体心脏裂解液模型中减轻了氧化应激的生化学标志物。这些发现支持对微藻多糖组分进行进一步研究，同时需要通过分子量测定以及键合特异性核磁共振（NMR）或甲基化分析来确定明确的β-葡聚糖结构。

研究背景与问题

心血管疾病仍是主要的健康负担，氧化应激是多种心肌损伤的重要组成。过量活性氧（ROS）会促进脂质过氧化、蛋白质氧化并破坏氧化还原调控的细胞过程，而铁离子可通过芬顿化学放大氧化损伤。天然多糖因其自由基清除能力、与蛋白质的相互作用及调节细胞信号传导的潜力，作为氧化和心血管代谢过程的潜在调节剂受到关注。β-葡聚糖尤为重要，但其物理化学和生物学性质强烈依赖于来源、分子量、分支度和糖苷键模式。微藻和硅藻是多糖的有吸引力的来源，但来自Amphora物种的多糖组分的结构特征和生物学特性尚不明确。在评估微藻β-葡聚糖用于食品或健康应用时，一个核心问题是经常在没有充分结构证据的情况下使用“β-(1→3)-葡聚糖”这一术语。单糖组成可以确定构成糖，但不能确定糖苷键连接位置；FTIR提供官能团和异头构型信息，但本身不能定义完整的多糖结构。此外，尽管有证据表明微藻β-葡聚糖可表现出生物活性，但将Amphora sp.的多糖组分与铁诱导的心脏组织氧化应激的生化反应联系起来的信息有限。本研究旨在填补这一空白，结合碳水化合物组成分析、FTIR表征以及一系列离体生化和脂质代谢测量。

研究方法概述

研究人员首先从南非Slangrivier分离了Amphora sp. WCA23.2菌株，并在50升跑道池中进行生物质生产。通过18s rRNA基因测序进行分子鉴定。采用索氏提取脱脂、热水提取、氯酸盐/乙酸盐缓冲液脱色、碱提以及透析纯化等步骤获得β-葡聚糖富集多糖组分，并使用Megazyme试剂盒定量β-葡聚糖含量。通过超高效液相色谱（UHPLC）结合蒸发光散射检测器（ELSD）分析单糖组成，使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行结构表征。在离体实验中，从雄性Wistar大鼠获取心脏组织并制备裂解液，使用FeSO₄诱导氧化应激，然后用不同浓度（30、60、120、240 μg/mL）的提取物进行处理。随后测定了一系列抗氧化指标（GSH、SOD、CAT、MDA、NO）和相关酶活性（ACE、AChE、ATPase、ENTPDase、脂肪酶），并分析了心脏脂质谱。最后，通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）进行脂质代谢物谱分析，并使用MetaboAnalyst 5.0进行通路分析。

研究结果

3.1 分子鉴定与β-葡聚糖含量

18s rRNA基因序列数据显示与Amphora sp.（JF834543.1）最相似，同源性为99.5%。该菌株被命名为Amphora sp.，登录号为MW721231。Amphora sp.生物质中的β-葡聚糖含量为8.97%（w/w），高于大多数谷物。

3.2 单糖组成

水解后的提取物主要检测到的单糖为葡萄糖（50%）、鼠李糖（28%）和甘露糖（22%）。葡萄糖占主导地位与硅藻中存在类似金藻昆布多糖的葡聚糖组分一致，但大量的鼠李糖和甘露糖表明该制备物是一种β-葡聚糖富集的多糖组分，而非均一的β-(1→3)-葡聚糖。

3.3 FTIR特征

FTIR光谱显示多糖的特征吸收峰，包括O-H伸缩振动（3411.27 cm^-1）、C-H振动（2946.85 cm^-1）、羧基（1367.63 cm^-1）、酯C=O键（1710.63 cm^-1）、吡喃环和C-O糖苷键（1078.62 cm^-1），以及在889.15 cm^-1处的特征峰，归因于β-糖苷键，表明Amphora sp.含有β型多糖。

3.4 心脏裂解液中的抗氧化反应

FeSO₄诱导的心脏损伤导致GSH水平显著降低，SOD和CAT活性下降，MDA水平升高。用Amphora sp. WCA23.2 β-葡聚糖提取物处理显著增加了CAT和SOD活性，同时降低了MDA水平，显示出抗过氧化活性。然而，GSH水平未发生显著改变。氧化损伤导致心脏NO水平显著升高，而提取物处理降低了NO水平，显示出抗炎潜力。ACE活性在损伤后显著升高，提取物处理使其活性下降。氧化损伤引起AChE活性显著升高，提取物处理显著降低了其活性。氧化应激改变了嘌呤能活性，表现为ATPase活性升高和ENTPDase活性降低，提取物处理呈剂量依赖性地降低了ATPase活性并提高了ENTPDase活性。氧化损伤后脂肪酶活性升高，提取物处理显著降低了其活性。

3.5 心脏脂质谱

氧化损伤后，心脏胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）水平显著升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）和甘油三酯水平相应降低。在240 μg/mL浓度下，β-葡聚糖提取物处理显著恢复了脂质谱，表现为LDL-c和胆固醇水平降低，甘油三酯和HDL-c水平升高。

3.6 GC–MS脂质代谢物谱

FeSO₄诱导的氧化应激导致心脏裂解液中多个关键脂质代谢物完全耗尽，包括2,6,10,15-四甲基十七烷、顺-9-二十三烯、十五烷酸、顺,顺-亚油酸、顺-10-十七碳烯酸、棕榈酸乙酯等。β-葡聚糖提取物处理的裂解液中出现了一些正常组和未处理组均不存在的代谢物，如角鲨烯、棕榈酸、(6Z)-6-十八碳烯酸等，并选择性恢复了先前耗尽的代谢物，如2,6,10,15-四甲基十七烷、十五烷酸、顺,顺-亚油酸和棕榈酸乙酯。氧化损伤破坏了视黄醇代谢途径，同时激活了甘油酯代谢、线粒体脂肪酸延伸、脂肪酸生物合成等相关脂肪酸代谢途径。β-葡聚糖及其提取物处理导致了脂质相关代谢通路的显著富集。

总结与结论

本研究表明，从底栖硅藻Amphora sp. WCA23.2获得的β-葡聚糖富集多糖组分含有8.97%的β-葡聚糖，主要由葡萄糖、鼠李糖和甘露糖组成。FTIR分析表明其为β型多糖，但现有数据不足以确定其为均一的β-(1→3)-葡聚糖结构。在一个离体FeSO₄诱导的心脏组织裂解液模型中，该组分增强了SOD和CAT活性，降低了MDA和NO水平，而GSH保持不变。它还调节了ACE、AChE、ATPase、ENTPDase和脂肪酶的活性，并在氧化胁迫后部分改善了心脏脂质谱。这些发现表明，该Amphora来源的组分能够在离体条件下减弱选定的氧化应激生化学标志物。然而，这些效应不应被解释为体内心脏保护作用。需要进一步的结构表征（使用分子量测定和键合特异性甲基化分析和/或NMR波谱法），以及细胞和动物研究，来确定这种微藻多糖组分的结构同一性、作用机制和生物学相关性。