基于阳离子交换色谱优化纯化工艺及热稳定性表征的骆驼乳乳铁蛋白研究

《Food Chemistry: X》：Optimization of purification process and thermal stability of lactoferrin from camel milk

　　

本研究建立了骆驼乳乳铁蛋白（CLF）的优化纯化工艺并明确了关键工艺参数。在72?°C和95?°C条件下、涵盖15?s至10?min的短时到长时加热处理中，CLF在72?°C下仅发生轻微构象改变，而在95?°C下则表现出随时间加剧的结构变化。CLF在高温下发生显著去折叠，但聚集作用受到抑制。本研究为CLF在热加工食品中的应用提供了理论基础。

一、研究背景与科学问题

骆驼作为干旱和半干旱地区重要的畜牧资源，为当地居民提供可持续的营养乳源。骆驼乳具有区别于牛乳的独特营养和生物活性特性，其中骆驼乳乳铁蛋白（CLF）是其核心功能组分之一。作为牛乳乳铁蛋白（BLF）的可行替代品，CLF表现出良好的抗病毒和抗肿瘤活性，在食品和制药工业中具有广阔的应用前景。CLF与BLF在分子量、等电点和乳中浓度方面存在差异：CLF分子量约为75–78?kDa，略低于BLF（78–80?kDa）；CLF等电点为8.5–9.0，BLF为8.0–9.0；骆驼乳中乳铁蛋白浓度为2.00–6.00?mg/mL，而牛乳中仅为0.10–0.40?mg/mL。

目前乳铁蛋白纯化的主流技术包括盐析法、离子交换色谱（IEC）和亲和色谱三类。盐析法操作简便、成本低且易于放大，但分离选择性差，产物纯度低；肝素亲和色谱可获得高纯度且天然构象完整的乳铁蛋白，但配基昂贵、处理通量低，仅适用于实验室规模的标准品和质谱样品制备；阳离子交换色谱（CEX）作为IEC的一种亚型，通过静电相互作用从乳清中选择性捕获乳铁蛋白，已成为BLF大规模生产的成熟工艺。然而，针对骆驼乳基质的高效CEX纯化方案仍然缺乏，制约了CLF生物活性和功能应用潜力的充分挖掘。

热处理是乳品制造中不可或缺的单元操作，用于消除病原微生物和延长产品货架期，但加热会改变乳铁蛋白的空间构象并损害其生物活性。已有研究系统表征了BLF在不同温度-时间组合下的构象演化和活性损失规律，但关于CLF热稳定性的系统研究仍然匮乏，工业加热参数与CLF构象变化之间缺乏定量关联，基础数据的不足限制了对CLF热响应特性及其在热加工乳制品中应用的理解。

二、研究内容与主要结论

针对上述研究空白，研究人员首先通过单因素实验和响应面法（RSM）建立了基于CEX的骆驼乳CLF优化纯化流程，并整合差示扫描量热法（DSC）、圆二色光谱（CD）、内源荧光光谱、紫外-可见光谱（UV–Vis）、动态光散射（DLS）和分子动力学（MD）模拟等多种表征手段，系统比较了CLF和BLF的热行为差异。研究采用两种工业加热制度（72?°C常规巴氏杀菌和95?°C强化巴氏杀菌）配合三种典型保温时间（15?s、2?min、10?min），系统阐明了CLF在不同热强度下的构象演化规律。

三、关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：以新疆乌鲁木齐水磨沟区包头骆驼养殖基地采集的骆驼乳和牛乳为原料，经脱脂、酸沉酪蛋白后获得乳清，采用CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱进行CLF纯化，通过单因素实验和Box-Behnken响应面设计优化色谱参数；以肝素亲和色谱制备CLF参考标准品，经超高效液相色谱（UPLC）和质谱（LC-MS/MS）鉴定纯度；利用DSC测定蛋白热变性温度，通过荧光光谱、UV–Vis光谱和CD光谱表征热诱导的构象变化，采用DLS测定热处理的粒径分布，并运用YASARA软件基于AMBER 14力场进行MD模拟，计算均方根偏差（RMSD）、回旋半径（R_g）和溶剂可及表面积（SASA）以评估构象稳定性。

四、研究结果

4.1 CLF纯化工艺的优化与验证

通过比较线性梯度、两步阶跃洗脱和多步梯度三种阳离子交换洗脱策略，研究人员确定两步洗脱（40% Buffer B洗涤杂质后以100% Buffer B洗脱目标蛋白）可获得尖锐的高纯度CLF峰。单因素实验表明，流速1.00?mL/min、pH?7.0–7.5、杂质洗脱浓度30%–40% Buffer B为最优条件范围。响应面优化建立的二次多项式回归模型（R2?=?0.9849）预测最优条件为流速1.01?mL/min、pH?7.09、杂质洗脱浓度32.78%，预测纯度90.4%。经操作便利性调整后（1?mL/min、pH?7.0、30%洗脱液），最终CLF纯度达90.13?±?1.06%，与预测值高度吻合。方法学验证显示精密度、重复性、稳定性和加标回收率的相对标准偏差（RSD）分别为3.74%、1.74%、1.49%和2.73%，均低于5%，表明工艺具有良好的重现性和稳健性。

4.2 热稳定性分析与结构表征

铁饱和度测定显示，纯化BLF和CLF的铁饱和度分别为27.19%和33.38%，差异仅6.19个百分点，两者均属于天然部分铁饱和乳铁蛋白，处于低至中等饱和度范围。DSC分析表明，BLF的两个结构域熔解温度（T_m）分别为72?°C和89?°C，而CLF对应值为67?°C和91?°C。CLF的N-叶T_m较低，表明其热稳定性较差；C-叶T_m较高，耐热性更强，两种蛋白的N-叶和C-叶表现出相反的热稳定性趋势。

荧光光谱分析显示，两种蛋白在加热后均出现最大发射波长的红移。72?°C处理15?s至10?min时，两种蛋白仅出现轻微红移和荧光强度逐渐增加，表明三级结构受到相对温和的扰动。95?°C长时间加热导致更显著的荧光变化，CLF的表观荧光强度增加了212.07%，而BLF仅增加36.80%，表明CLF色氨酸残基周围微环境受到更强烈的扰动。

UV–Vis光谱分析表明，72?°C加热后CLF在280?nm附近的吸光度增幅大于BLF，显示更强烈的增色效应。95?°C加热时，两种蛋白均出现280?nm吸光度增加和350–600?nm基线抬升（反映分子间聚集引起的长波长光散射），但CLF在350–600?nm区域的基线抬升程度小于BLF，表明CLF形成较大分子聚集体的倾向较弱。

CD光谱分析显示，72?°C加热10?min仅引起两种蛋白CD光谱的微小变化，而95?°C加热导致210?nm附近负椭圆率逐渐降低，表明二级结构发生显著重排。二级结构拟合结果显示，天然CLF的β-折叠比例高达30.8%。72?°C加热下，BLF的二级结构组分变化有限，而CLF的α-螺旋比例从8.8%增至20%以上。95?°C加热2?min后，BLF的α-螺旋比例从22.8%降至7.6%，β-折叠增至31.9%；CLF同样出现α-螺旋贡献显著下降和β-折叠相对增加。β-转角比例在整个热处理过程中保持相对稳定，无规卷曲贡献随加热强度增加而适度上升。

DLS分析显示，天然BLF和CLF具有较低的Z均流体力学直径（D_z）和多分散指数（PDI）。72?°C加热15?s和2?min对D_z无显著影响，仅10?min加热引起适度增加。95?°C下，CLF的D_z和PDI随保温时间延长呈中度增加，且在所有时间点的D_z值均低于BLF，表明CLF形成大聚集体的倾向较低；BLF则表现出更显著的粒径响应。

五、讨论与结论

综合荧光光谱、UV–Vis和CD分析结果，热诱导的BLF和CLF结构变化同时涉及三级和二级结构扰动。值得注意的是，CLF在剧烈加热下表现出更显著的结构重排，而BLF在UV–Vis光谱中表现出更强的长波长光散射，这种对比性的光谱响应提示BLF和CLF在热诱导结构扰动后的分子间缔合倾向可能存在差异。MD模拟进一步从分子层面支持了上述实验观察。该研究构建了可转移的CLF纯化工作流程，阐明了CLF在实际乳品加工条件下的热变性机制，为乳铁蛋白的规模化生产和热工艺优化提供了实验参考，有助于推动骆驼乳资源的高值化开发利用。