磷脂作为豌豆蛋白乳液的共稳定剂：从快速吸附到长期界面结构的形成

《Food Hydrocolloids》：Phospholipids as Co-Stabilisers of Pea Protein Emulsions: From Rapid Adsorption to Long-term Interfacial Structures

　　• 磷脂酰胆碱通过共吸附增强乳液的短期稳定性
• 饱和磷脂酰胆碱形成混合界面网络
• 即使在临界乳化浓度（CRMC）下，饱和磷脂酰胆碱也能增强豌豆蛋白乳液的稳定性
• 不饱和磷脂酰胆碱在CRMC下会取代豌豆蛋白
• 不饱和磷脂酰胆碱在CRMC以下与豌豆蛋白共存

**引言**
由于需要设计更稳定、更可持续的乳液系统，植物蛋白作为界面配方中的结构剂越来越受到关注。其中，豌豆蛋白因其低致敏性和在欧洲广泛的农业可用性而受到特别关注。豌豆蛋白具有复杂的结构异质性，包括球蛋白（约65-80%）和水溶性白蛋白（约10-20%）（Mession等人，2013；Olsmats和Rennie，2024）。富含球蛋白的部分（GRF）通常用于乳化目的，因为它是豌豆蛋白分离过程中获得的主要蛋白质部分（Kornet等人，2022）。然而，豌豆蛋白球蛋白通常具有复杂的三级和四级结构（Balny和Masson，1993），这常常导致吸附动力学缓慢（Kontogiorgos和Prakash，2023）。此外，这些蛋白质的溶解度较低，限制了用于形成界面网络的蛋白质量（Ding等人，2026；Baune等人，2021），并且在界面处的展开能力有限，从而降低了界面粘弹性（Yang和Sagis，2021）。因此，豌豆蛋白球蛋白往往表现出缓慢的吸附动力学和延迟的膜形成，这可能会根据配方和加工条件导致乳液随时间更容易发生聚并（Münch等人，2024）。因此，它们在乳化食品系统中的应用仍然具有挑战性。

已经提出了多种策略来增强基于植物蛋白的乳液系统的短期和长期稳定性。一种常见的方法是将植物蛋白与其他表面活性组分（如乳蛋白（Grasberger等人，2022；Hinderink等人，2019a, 2021；Neofytos等人，2025）或表面活性剂（Münch等人，2024）结合使用，以提供互补的界面性能。例如，乳蛋白通常吸附更快，更容易展开，并形成更粘弹性的界面膜（Grasberger等人，2022；Hinderink等人，2019a, 2021；Neofytos等人，2025），而低分子量表面活性剂可以迅速吸附到新形成的界面并降低界面张力（Bylaite等人，2001；Dickinson和Yamamoto，1996；He等人，2008；McClements和Jafari，2018；Sunder等人，2001；Waninge, Walstra, Bastiaans, Nieuwenhuijse, Nylander, Paulsson, & Bergenst?hl，2005；Yesiltas等人，2019）。在表面活性剂中，磷脂特别有趣，因为它们天然存在于许多基于植物和乳制品的乳液中，因此与清洁标签配方策略兼容。然而，它们的天然浓度通常不足以确保足够的界面覆盖和稳定性，这往往需要在配方过程中添加磷脂（Rachtan-Janicka等人，2025）。为了实现多尺度乳液稳定性，需要快速吸附（如磷脂），然后是弹性膜的形成（高界面覆盖，通常由蛋白质驱动）。因此，当磷脂与蛋白质结合使用时似乎是最合适的，因为可以达到比单独使用任一组成分更密集和更快速的界面堆积（Bylaite等人，2001；Dickinson和Yamamoto，1996；He等人，2008；McClements和Jafari，2018；Sunder等人，2001；Waninge, Walstra, Bastiaans, Nieuwenhuijse, Nylander, Paulsson, & Bergenst?hl，2005；Yesiltas等人，2019）。然而，混合物的使用也可能导致竞争性吸附或时间依赖性的取代，其中更具表面活性的组分（这里是磷脂）在界面处取代另一种组分（这里是蛋白质），以达到最低的吉布斯自由能状态（Miller等人，2005）。这一竞争性取代过程已在Mackie及其同事的开创性工作中得到广泛描述（Mackie等人，1999b, 1999a；Mackie, Gunning, Ridout, Wilde, & Morris，2001；Zhang等人，2022b）。像β-乳球蛋白这样的乳蛋白会形成高度弹性和可压缩的界面网络（Mackie等人，1999a）。在这种乳蛋白-表面活性剂系统中，降低界面张力最初会压缩富含蛋白质的区域，一旦达到压缩极限，蛋白质层就会发生弯曲。在足够低的界面张力下，蛋白质网络最终会分解，蛋白质会被迫进入连续相（Mackie等人，1999b, 1999a；Mackie, Gunning, Ridout, Wilde, & Morris，2001；Zhang等人，2022b）。

从互补的热力学角度来看，Miller及其同事描述的传统吸附概念强调，具有高度负吸附自由能的蛋白质表现出低脱附率，因此一旦吸附就具有动力学稳定性（Fainerman等人，1996, 2005；Kotsmar等人，2009；Miller等人，2000, 2004, 2013；Pradines等人，2011）。然而，蛋白质的有效吸附自由能并非恒定，而是取决于其构象和界面环境。在低界面覆盖率下，蛋白质可能会（部分）展开，以最大化与油相的疏水相互作用。随着界面覆盖率的增加，空间限制会限制展开，并可能迫使蛋白质进入更紧凑的构象，具有更小的分子界面面积。尽管界面变得更加密集，但单个蛋白质分子可能与较少的片段同时相互作用，从而降低其有效结合强度。此外，与磷脂的复杂形成会进一步改变蛋白质构象和界面亲和力。在这两种情况下，有效吸附自由能变得不那么负，增加了脱附的可能性（Fainerman等人，1996, 2005；Kotsmar等人，2009；Miller等人，2000, 2004, 2013；Pradines等人，2011）。

普遍认为，竞争性取代过程取决于几个因素，如：蛋白质与表面活性剂的比率（Bai和McClements，2016；Bos和van Vliet，2001；Cornell和Patterson，1994；Courthaudon等人，1991；Münch等人，2024；Waninge, Walstra, Bastiaans, Nieuwenhuijse, Nylander, Paulsson, & Bergenst?hl，2005）、混合顺序（McClements和Jafari，2018；Nylander等人，2019；Waninge, Walstra, Bastiaans, Nieuwenhuijse, Nylander, Paulsson, & Bergenst?hl，2005），以及这两种物质之间的相互作用程度及其是否协同（Bylaite等人，2001；Sunder等人，2001；Yesiltas等人，2019；Zhang等人，2022）。对于乳蛋白-磷脂混合物，已经表明蛋白质-磷脂相互作用及其产生的界面组成取决于磷脂的脂肪酸链饱和度。饱和磷脂可以与乳蛋白发生有利的共吸附，促进磷脂-蛋白质相互作用和混合界面膜的形成，从而增强乳液稳定性。另一方面，不饱和磷脂由于其更高的界面活性和每个分子在界面上的较大面积，往往会取代蛋白质，导致界面弹性降低，从而降低乳液稳定性（Risse, Bridot等人，2025；Risse, Nikiforidis等人，2026）。此外，PC 18:0由于其较高的熔点，在室温下预计处于更有秩序的半晶体状态，而PC 18:1则保持更流动的状态（Risse, Bridot等人，2025；Risse, Nikiforidis等人，2026）。这种相行为的差异导致不同的界面堆积密度，这已被证明会影响混合乳蛋白-磷脂系统的界面性能（Risse, Bridot等人，2025；Risse, Nikiforidis等人，2026）。对于植物蛋白，它们与磷脂相互作用的机制，特别是关于界面处的潜在取代，尚未完全理解。关键问题不是是否会发生取代，而是界面组织、构象适应性和蛋白质-磷脂相互作用如何控制取代的动力学和程度。这个问题对于基于植物的配方尤其相关，因为在油水界面中，磷脂通常天然存在并不可避免地与蛋白质共吸附。因此，了解这些混合层如何随着表面压力的增加而演变对于合理调节乳液稳定性和防止意外失稳定至关重要。需要进行系统研究以阐明控制机制并建立植物蛋白-磷脂稳定界面的结构-功能关系。

本研究旨在探讨通过在油水界面共吸附磷脂来改善基于GRF的乳液的短期（毫秒至秒）和长期（分钟至小时）稳定性，并了解混合界面层的动态演变。使用了两种磷脂：含有两个C18:0脂肪酸链的饱和磷脂（PC 18:0）和含有两个C18:1脂肪酸链的不饱和磷脂（PC 18:1），以评估脂肪酸链饱和度如何影响界面行为和最终的乳液稳定性。选择这两种磷脂是因为它们在与乳蛋白的混合系统中表现出最明显的差异，使我们能够评估观察到的界面机制是否可以转移到植物蛋白系统中（Risse, Bridot等人，2025；Risse, Nikiforidis等人，2026）。为了捕捉乳液化的多尺度特性，我们使用了不同时间尺度（毫秒到小时）和长度尺度（分子吸附、界面级力学和液滴级稳定性）的互补技术（图1）。微流控工具用于探测毫秒级的早期聚并事件，而液滴大小演变和界面覆盖率则通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）在分钟到小时的时间尺度上进行分析。界面剪切和膨胀流变学，包括一般应力分解（GSD），用于研究网络形成、粘弹性贡献和表面活性剂-蛋白质交换动态。这种多模态方法全面评估了磷脂的脂肪酸链饱和度如何控制基于豌豆蛋白的乳液稳定性，并确定了出现协同或竞争行为的条件。实验框架总结在图1中，该图展示了这些互补技术是如何结合的，以及不同时间尺度和长度尺度上发生的过程是如何关联的。

**材料与方法**
豌豆粉（“Smart Yellow Pea”，约30%蛋白质含量）由GoodMills Innovation（德国汉堡）提供。高纯度（≥99.8%）的磷脂酰胆碱，含有硬脂酰（18:0）或油酰（18:1）脂肪酸链（PC 18:0/18:0和PC 18:1/18:1；Lipoid GmbH，德国路德维希港），由制造商提供。中链甘油三酯油（WITARIX? MCT 60/40）（MCT油）因其高热氧化稳定性而被选中，确保油的化学稳定性。

**乳液在短时间尺度（毫秒至秒）的稳定性**
作为第一步，使用微流控工具（通道和显微镜）评估新形成的液滴的聚并稳定性，从而探测在毫秒至秒的时间尺度上豌豆蛋白（GRF）和磷脂（PL）在油-水界面上的共吸附（图2）。在微流控装置中，油滴在T型接头处生成，然后通过一个蜿蜒的吸附通道，进入一个更宽的聚并通道。

**结论**
在这项研究中，我们系统地研究了豌豆蛋白（GRF）和GRF-磷脂酰胆碱（PC）界面的界面性质和由此产生的乳液稳定性，重点关注脂肪酸链饱和度（PC 18:0与PC 18:1）的影响。为了获得多个过程和时间尺度的全面图景，我们结合了一组互补方法，从微流控技术解析毫秒至秒时间尺度的聚并事件，到乳液表征。

**作者贡献声明**
Constantinos Nikiforidis：写作——审稿与编辑，数据管理。
Imogen Morris：写作——审稿与编辑。
Emma Hinderink：写作——审稿与编辑。
Karin Schroen：写作——审稿与编辑。
Stephan Drusch：写作——审稿与编辑。
Kerstin Risse：写作——原始草稿，可视化，验证，项目管理，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。

**未引用的参考文献**
Bylaite等人，2001a；Bylaite等人，2001b；Hinderink等人，2019；Mackie等人，2001；McClements和Jafari，2018a；McClements和Jafari，2018b；Muijlwijk等人，2016；Risse等人，2025a；Risse等人，2026a；Risse等人，2026b；Risse等人，2025c；Sunder等人，2001a；Sunder等人，2001b；Waninge等人，2005b；Yesiltas等人，2019a；Yesiltas等人，2019b；Zhang等人，2022a。

**关于生成式AI和AI辅助技术的声明**
为了支持语言质量，选择性地使用了基于AI的工具（ChatGPT，OpenAI v4.0；Grammarly v6.8.263）进行校对（拼写、语法和风格）。这些工具从未用于生成内容或文本。科学的构思、分析和结果的解释完全由作者独立完成。

**利益冲突声明**
作者声明不存在利益冲突。本手稿尚未发表，也没有考虑在其他期刊上发表。所有作者均同意本手稿的内容，并同意将其提交至《食品水胶体杂志》（Journal of Food Hydrocolloids）。

致谢
作者们想要感谢Anteun de Groot提供了用于GSD分析的MATLAB代码。该IGF项目（01IF23169N）由FEI负责实施，得到了联邦经济事务与气候行动部（BMWK）推动工业集体研究（IGF）计划的支持，该计划基于德国议会的决议。

作者名单：
Kerstin Risse | Constantinos V. Nikiforidis | Imogen Morris | Emma Hinderink | Karin Schro?n | Stephan Drusch