基于定量微生物组谱学与多组学风味分析的酸肉发酵过程中微生物群落演替与风味形成机制研究

《Food Chemistry: X》：Microbial community evolution and flavor formation during sour meat fermentation: Integrated quantitative microbiome profiling, HS-SPME-GC–MS, and UPLC-Q-TOF-MS/MS

　　

酸肉的发酵分为前发酵和后熟两个阶段。葡萄球菌属（Staphylococcus）和假丝酵母属（Candida）是成熟期的主要细菌和真菌属。酯类、游离氨基酸和多不饱和脂肪酸是主要的风味物质。微生物在前发酵阶段快速增殖，形成风味的物质基础。在后熟阶段，风味物质持续积累，产品风味逐渐形成。本研究采用定量微生物组谱学（quantitative microbiome profiling）结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）和超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，揭示了酸肉发酵过程中微生物群落的真实动态及其与风味形成的关联。结果表明，核心菌群包括葡萄球菌属、魏斯氏菌属（Weissella）和假丝酵母属，它们在不同发酵阶段发挥特异性代谢功能：早期快速生长产生初级风味前体物，而后期群落稳定则将中间产物转化为特征性感官代谢物如乙酯类和呈味肽。定量微生物组谱学克服了传统相对丰度扩增子测序的局限性，为功能性微生物贡献风味代谢提供了可靠解读。

一、研究背景与科学问题

酸肉是一种拥有两千多年历史的传统发酵肉制品，通过将新鲜猪肉切片与盐和糯米饭混合后在密封条件下进行厌氧发酵制成。其独特的风味深受消费者喜爱，而风味形成主要依赖于原料肉中的内源酶以及发酵微生物群落的协同代谢活动。然而，目前酸肉生产仍以家庭作坊式自然发酵为主，批次间风味一致性差、易发酵失败，难以实现工业化标准化生产。因此，阐明酸肉发酵过程中微生物群落与风味物质之间的内在联系，对于筛选靶向发酵剂、提升产品质量具有重要意义。

现有研究多采用高通量测序揭示微生物多样性，但依赖相对丰度分析无法反映微生物实际数量的变化，可能对微生物演替规律产生误导。相比之下，定量微生物组谱学通过测量绝对丰度，能够更准确地反映微生物群落动态及其与代谢物生成的关联。此外，关于酸肉发酵中风味物质与天然微生物组关系的研究尚不充分，关键风味代谢物及其驱动微生物仍有待解析。

二、研究设计与主要结论

研究人员从贵州省贵阳市当地市场采购新鲜猪五花肉，经清洗、切块后，以5%（w/w）食盐腌制2小时，再与10%（w/w）熟糯米粉混合均匀，分装至30个陶瓷发酵罐中，于25℃密封发酵。分别在发酵第0、14、28、42、56和70天随机选取三个发酵罐取样，进行后续理化、微生物和感官分析。研究得出以下主要结论：酸肉发酵呈现明显的双相模式——前期（0-28天）为微生物快速增殖期，后期（28-70天）为风味成熟期。核心菌群如葡萄球菌属、魏斯氏菌属和假丝酵母属在不同阶段发挥特异性代谢功能：前期快速生长分解蛋白质和脂类生成风味前体物，后期群落稳定后将中间产物转化为乙酯类和呈味肽等特征性感官代谢物。定量微生物组谱学为功能性微生物的风味代谢贡献提供了可靠的定量信息，为理性设计和精准工程化合成发酵剂菌群提供了可行思路。

三、关键技术方法

1. 1.
   绝对定量微生物组分析：向DNA提取前样品中加入12种合成的原核16S rRNA基因内参序列（spike-in），浓度梯度为10³至10⁶拷贝，通过高通量测序（Illumina NextSeq 2000平台）结合内参标准品计算微生物绝对丰度。细菌16S rRNA基因V3-V4区引物为341F/806R，真菌ITS1区引物为ITS-1F/ITS-1R。
2. 2.
   挥发性风味化合物分析：采用顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS），鉴定挥发性有机化合物（VOCs）。
3. 3.
   非挥发性风味化合物分析：采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS），分析氨基酸、脂肪酸、核苷酸等非挥发性代谢物。
4. 4.
   统计与关联分析：主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、Spearman相关性分析和PICRUSt2功能预测。

四、研究结果

3.1 发酵微生物的群落结构

α-多样性指数显示，发酵过程中细菌和真菌的丰富度和多样性均下降，Simpson指数升高，表明少数优势菌群通过竞争性富集占据主导地位。绝对丰度分析表明，细菌总量从第0天的10⁶拷贝/g迅速增至第28天的10⁹拷贝/g，进入指数增长期；此后趋于平稳。门水平上，初始阶段变形菌门（Proteobacteria）占优（约71%），随后厚壁菌门（Firmicutes）成为绝对优势菌门（相对丰度>98%，绝对丰度达10⁹拷贝/g）。属水平上，第0天埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）占优；第14天魏斯氏菌属成为首要菌属（增至5.8×10⁸拷贝/g），标志着大量产酸开始；第28天后葡萄球菌属成为最优势菌属（达1.1×10⁹拷贝/g），其对酸性和高盐环境的耐受性赋予竞争优势，其分泌的胞外酶促进蛋白水解和脂质氧化。真菌方面，子囊菌门（Ascomycota）最终占真菌总量的99%。属水平上，第0天枝孢属（Cladosporium）占优；第14天后假丝酵母属成为主导真菌属（增至7.7×10⁶拷贝/g），其兼性厌氧代谢和耐酸性使其能在低氧低pH环境中生存，并通过EMP途径和Ehrlich途径生成乙醇和芳香化合物。德巴利酵母属（Debaryomyces）为第二优势真菌属，具有蛋白水解和脂肪水解活性，与酯类合成密切相关。

3.2 酸肉风味指纹图谱

HS-GC-IMS共鉴定出61种单体挥发性化合物。OPLS-DA识别出17种VOCs为主要香气贡献物。三维和二维图谱显示，未发酵样品（D0）中VOC丰度显著低于发酵样品，D14-D28期间出现新的挥发性代谢物，D42-D70样品VOC组成相似但含量有差异，表明后期发酵趋于稳定。指纹图谱揭示风味演变呈双相模式：前28天建立以醇类、醛类和酮类为基础的风味轮廓；后阶段酯类成为主导化合物，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯和己酸乙酯，这些酯类是酸肉特征香气的关键成分。

3.3 不同发酵时间VOCs比较

HS-SPME-GC-MS共鉴定出89种挥发性化合物，其中酯类最多（29种）。PCA显示前两主成分累计解释82.2%变异，第0-56天样品沿主成分方向逐步分离，而56天与70天样品区分不明显，表明后期进入稳定期。基于VIP>1和P<0.05筛选出37种差异挥发物。酯类整体呈上升趋势，赋予果香、甜香、花香和酒香等愉悦感官属性。醛类中庚醛和辛醛在第28天达到峰值，来源于亚油酸和油酸的氧化降解。第70天样品中挥发性酸浓度显著升高，在适当浓度下贡献酸味和干酪香。结果表明，成熟期酸肉富含乙酯类和羧酸，增强了果香、花香和酸香特征。

3.4 不同发酵时间非挥发性有机物比较

UPLC-Q-TOF-MS/MS共鉴定出54种差异代谢物，包括氨基酸及其衍生物、脂肪酸和核苷酸。游离氨基酸总量随发酵显著增加，第70天达峰值，但因感官阈值较高，对风味的直接贡献有限。鲜味肽在第70天累积最多，主要由谷氨酸和天冬氨酸残基贡献鲜味，同时兼具酸、甜或微苦的多维风味特性。特定不饱和脂肪酸如肉豆蔻烯酸和二高-γ-亚麻酸显著增加，其氧化降解可生成醇、醛、酮等风味活性物质。AMP和IMP等核苷酸在发酵后浓度显著降低，表明核苷酸对最终风味贡献较小。总体而言，酸肉的鲜味和香气主要由脂质氧化和氨基酸降解产物协调决定。

3.5 微生物与风味物质的Spearman相关性分析

20个微生物属（10个细菌属和10个真菌属）与87种风味化合物之间存在强相关性。大多数酯类和多种有机酸与葡萄球菌属和假丝酵母属呈显著正相关（P<0.05，r>0.75）。葡萄球菌属被广泛报道参与棕榈酸乙酯、油酸乙酯等多种酯类的生物合成。氨基酸作为酸肉中最丰富的非挥发性风味物质，与多数优势微生物属呈正相关，表明微生物普遍参与蛋白水解和氨基酸代谢。葡萄球菌属与多种游离氨基酸及鲜味肽（如天冬氨酰-苯丙氨酸、谷氨酰-异亮氨酸）呈强正相关，凸显其在生成呈味活性物质和前体物中的关键作用。己酸、脱氧有机酸和2-羟基硬脂酸也与葡萄球菌属和假丝酵母属显著正相关。综上，葡萄球菌属和假丝酵母属是与酸肉发酵中挥发性风味物质（尤其酯类和有机酸）和非挥发性呈味代谢物（尤其游离氨基酸）产生相关的主要功能性微生物群。

3.6 微生物功能预测

基于PICRUSt2的功能基因预测显示，底物降解和风味化合物生物合成相关的酶基因丰度在发酵过程中逐步增加，第42天达到峰值，之后随微生物生长减缓而下降。构建的代谢网络表明：糯米粉中的淀粉经糖化酶和α-淀粉酶水解为葡萄糖，再经糖酵解生成丙酮酸；丙酮酸可转化为乳酸、乙酸和乙醇等风味活性物质，也可进一步生成乙酰辅酶A进入TCA循环。脂质代谢中，脂肪酸经酯化反应生成多种挥发性酯类。蛋白质降解释放的游离氨基酸经转氨酶等催化生成α-酮酸，进而转化为羧酸、醛和醇等风味物质。需指出，所有代谢通路均为基于标记基因序列的计算机模拟预测。

五、讨论与结论

本研究通过定量微生物组谱学结合多组学风味和代谢组学分析，揭示了酸肉发酵中微生物介导的风味形成机制。研究表明，酸肉发酵呈现明显双相模式：前期（0-28天）为微生物快速增殖期，后期（28-70天）为风味成熟期。核心菌群如葡萄球菌属、魏斯氏菌属和假丝酵母属在不同阶段发挥特异性代谢功能：前期快速生长分解肉中蛋白质和脂类生成初级风味前体物，后期群落稳定后将中间产物转化为乙酯类和呈味肽等特征性感官代谢物。定量微生物组谱学克服了传统相对丰度扩增子测序的局限，为功能性微生物的风味代谢贡献提供了可靠定量信息。这些发现为理性设计和精准工程化合成发酵剂菌群、调控酸肉潜在感官特性提供了可行依据。然而，本研究的分类分辨率仅限于属水平，掩盖了同一属内种间和株间的功能异质性，未来需开展菌株水平研究以揭示菌株特异性代谢特性。此外，与风味化合物呈负相关的低丰度属未被深入表征，其在酸肉微生物群落中的生态作用值得进一步探究。