《Food Chemistry: X》：Interaction-driven chorismate metabolic reprogramming underlies
Bacillus–
Pediococcus synergistic thermogenesis in high-temperature
Daqu
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高温大曲（High-temperature Daqu，HTD）是优质酱香型白酒生产所必需的关键固态发酵剂，其发酵温度峰值可达60–65?°C，这一高温环境由微生物代谢产热驱动；然而，Bacillus–Pediococcus协同产热的详细代谢机制至今仍未得到充分
高温大曲（High-temperature Daqu，HTD）是优质酱香型白酒生产所必需的关键固态发酵剂，其发酵温度峰值可达60–65?°C，这一高温环境由微生物代谢产热驱动；然而，Bacillus–Pediococcus协同产热的详细代谢机制至今仍未得到充分解析。本研究整合等温微量热法（isothermal microcalorimetry）、时间分辨转录组学（time-resolved transcriptomics）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics），在热胁迫条件下解析了这一协同产热机制，并在模拟大曲制备系统中进行了进一步验证。研究人员鉴定出一个代谢互作与通量重定向网络：热诱导的细胞周转将细胞氮释放至共享氮库，Pediococcus通过贡献芳香族氨基酸生物合成，支持Bacillus的呼吸产热输出。分支酸（chorismate）被鉴定为关键代谢分支节点，其代谢通量被重定向至酪氨酸和甲萘醌（menaquinone）生物合成，以维持代谢周转、增强电子传递效率并减轻氧化损伤。这些发现为HTD的精准化、标准化工业生产提供了理论基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
高温大曲（High-temperature Daqu，HTD）是以小麦为原料、在严格控制的固态条件下于60–65?°C发酵而成的传统发酵剂，被誉为优质酱香型白酒酿造中的“酒之骨”。HTD的发酵过程涉及两次关键翻曲操作——首次翻曲（First Daqu Turning，FT）和二次翻曲（Second Daqu Turning，ST）——以确保整个曲堆的热均匀性。这些操作诱导了包含初始升温、冷却和二次升温的特征性温度循环，划分出三个不同的发酵阶段，其中第一阶段温度最高且最为关键。HTD不仅是发酵剂，更是微生物、酶和底物系统的复杂载体，从根本上决定了成品白酒的感官特征、品质一致性和经济价值。高温特性驱动了一系列酶促和非酶促反应，尤其是美拉德反应，产生吡嗪类、酚类和呋喃类化合物，构成酱香风味轮廓的骨架。因此，在FT之前的临界发酵阶段（第0–9天）精确调控温度轨迹至关重要，任何偏差都会破坏微生物演替、酶动力学和风味前体形成，最终损害产品质量和一致性。
HTD标志性高温环境（60–65?°C）的产生源于微生物代谢产热与固态底物隔热性能之间的动态相互作用。热量积累主要来自堆曲内栖居微生物对碳水化合物、蛋白质和脂质的放热氧化。尽管底物组成、水分含量和通气状况同时影响产热与散热，但微生物群落内的功能互作已被认为是热力学的关键决定因素。近期证据进一步表明，HTD产热并非由单一嗜热类群主导，而是由微生物群落内的协同互作所调控。特别值得注意的是，发酵温度升至45?°C的时间点已被确定为温度轨迹分叉的关键节点：发酵良好的批次可达到正常的60–65?°C范围，而发酵不足的批次则无法达到该发酵温度。Bacillus与Pediococcus之间的协同互利关系已被鉴定为产热的关键驱动因素，两属间的适当平衡与最佳热性能密切相关。共培养实验证明，其代谢产热量显著高于任一单培养，凸显了Bacillus–Pediococcus互作作为HTD热动力学核心调节因子的重要性。
然而，支撑Bacillus–Pediococcus热协同的分子机制此前完全未获解析，这构成了HTD发酵理性工艺优化的关键机制空白。已有证据提示两条可能相互关联的途径：其一，代谢互作可能促进氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）——HTD产热的主要来源；其二，种间合作可能提升群落水平的耐热性。尽管Bacillus物种天然是强呼吸微生物，而Pediococcus单独培养时产热较低，但某些Pediococcus菌株具备呼吸或氧化还原调控能力。研究人员因此假设Pediococcus通过供给能更高效进入三羧酸循环和电子传递链的中间代谢物、调节局部氧化还原条件或pH、以及通过信号互作刺激关键OXPHOS酶复合物的表达，从而增强Bacillus的产热。为填补这一认知空白，本研究整合等温微量热法、时间分辨转录组学和非靶向代谢组学，系统解析热胁迫下种间互作的代谢基础。
二、研究内容与主要结论
本研究以分离自HTD首次翻曲阶段的两株优势菌——Bacillus velezensis YF83（BV）和Pediococcus acidilactici YF45（PA）——为研究对象，通过等温微量热法测定不同接种比例共培养体系在25?°C和45?°C下的产热特征，结合时间分辨转录组学和非靶向代谢组学分析共培养与单培养的差异，并在模拟HTD发酵系统中进行验证。研究得出以下核心结论：共培养体系的持续产热增强并非源于两物种群体丰度的简单平衡，而是与高温条件下以BV为主导、PA持续参与的动态共存格局相关；共培养驱动的功能重编程涉及氮素获取、能量转化和环境适应的协同变化；热胁迫下细胞周转释放的氮素进入共享氮库，Pediococcus贡献的芳香族氨基酸生物合成支持Bacillus的呼吸产热；分支酸（chorismate）作为中心代谢分支节点，其通量被选择性重定向至酪氨酸和甲萘醌（menaquinone，MK）生物合成，以维持代谢周转、增强电子传递效率并减轻氧化损伤。该机制在模拟工业大曲发酵系统中得到验证，表明受控共培养条件下鉴定的互作在更复杂的开放发酵环境中仍保持功能活性。
三、关键技术与方法
研究人员采用了以下核心技术手段：等温微量热法（isothermal microcalorimetry）用于实时监测单培养和共培养体系的产热动力学；时间分辨转录组学（time-resolved transcriptomics）基于DNBSEQ-T7平台进行原核RNA测序，通过de novo组装和KEGG功能注释解析功能通路变化；非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）采用UPLC–MS/MS技术进行代谢物鉴定与定量；生物量加权期望模型（Ew = fBV × MBV + fPA × MPA）用于区分共培养中由种间互作诱导的功能响应与生物量组成变化的贡献；共存强度（coexistence strength，CS）和动态共存稳定性指数（dynamic coexistence stability index，DCSI）基于Lotka–Volterra竞争模型评估群落共存动态；模拟HTD发酵系统用于验证机制在工业生产样环境中的适用性。菌株均分离自高温大曲首次翻曲阶段，模拟发酵所用小麦和稻草来源于中国贵州省仁怀市茅台镇某酱香型白酒生产企业。
四、研究结果
3.1 共培养过程中种群组成与共存动态的变化
等温微量热分析显示，在25?°C下，体系总产热能力随BV比例增加而提高，少量PA的引入可在培养中后期进一步增强产热。在45?°C下，所有共培养体系的累计产热量均显著高于相应单培养。共存强度分析表明，25?°C下50:50处理组在12?h时CS接近理论最大值0.25，呈现稳定共存；45?°C下则呈现温度驱动的选择效应，BV趋于优势，但PA并未被完全消除，至12?h时50:50组相对丰度恢复至约32.2:67.8，CS升至0.218。DCSI分析进一步表明，BV主导的接种组在45?°C、12?h时表现出更大的共存动态。结论：持续产热增强与BV主导、PA持续参与的动态共存格局相关。
3.2 与产热相关的核心功能通路转录响应模式
对50:50共培养体系进行转录组分析，共鉴定209条KEGG通路，其中67条与碳代谢、能量代谢、氨基酸代谢、环境感知和热适应相关。生物量加权差异分析显示，45?°C下共培养在6?h即出现大量正转录响应并持续至12?h，功能上集中于氮和氨基酸代谢、能量与氧化还原代谢。通路层面，TCA循环、2-氧代羧酸代谢、鞭毛组装、硫辛酸代谢和氨基酸生物合成及降解通路持续高表达，而糖酵解/糖异生通路变化有限。来源分析表明，Pediococcus主要贡献芳香族氨基酸生物合成和泛醌及其他萜类醌生物合成通路，两者均与Bacillus绝对生物量同步上升。结论：热胁迫下共培养形成以碳-氮代谢重组和能量转化增强为中心的协调功能轮廓。
3.3 产热相关代谢物的转化
非靶向代谢组学分析显示，共培养建立了区别于任一单培养的独特代谢谱。UpSet分析表明共培养含有大量与单培养不完全重叠的高丰度代谢物，提示种间互作产生了非加和性的新型代谢状态。应激保护性代谢物Fraxetin和吲哚乳酸（Indolelactic acid）在6?h和12?h均持续高于单培养加和值，HMTBA仅在6?h升高。共培养中多数关键通路相关代谢物低于生物量加权期望值，且这些通路与转录组中持续上调的产热相关代谢和呼吸通路高度对应，表明代谢物被积极消耗并汇入下游反应，代谢周转率升高。分支酸呈现最显著的时间动态：6?h时较Ew积累4.7倍，12?h时降至0.5倍；L-酪氨酸呈相反趋势，随分支酸下降而富集。结论：分支酸作为关键代谢分支节点，其从积累到快速消耗的转变支撑了共培养后期持续产热。
3.4 共培养持续产热的互作机制
整合转录组与代谢组数据构建了产热机制模型。45?°C下双组分系统通路显著富集，反映细胞对温度、营养和群落状态感知能力的增强，同时伴随细胞损伤和周转率升高。细胞裂解持续释放蛋白质、肽和游离氨基酸，形成可再生的群落氮库。鞭毛组装和生物膜形成通路的上调指示结构重组和环境适应，这些过程产生大量呼吸相关能量需求。碳代谢方面，淀粉蔗糖代谢和糖酵解/糖异生通路在6?h显著上调但12?h减弱，提示能量获取策略的动态转变。硫辛酸代谢和硫代谢的上调可能旨在维持热胁迫下丙酮酸脱氢酶（PDH）和α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）的呼吸碳通量。随着碳水化合物来源的能量生成下降，共培养日益依赖积累的游离氮化合物，赖氨酸降解、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和支链氨基酸降解等通路显著富集，其降解产物通过回补反应补充TCA循环底物。氮代谢和莠去津类化合物降解通路持续上调，反映降解含氮底物、增加氨生成和中间氮代谢物可利用性的增强能力。分支酸代谢方面，自定义的分支酸生物合成通路（28个aro家族基因）在6?h和12?h分别较Ew上调6.1倍和9.2倍。四条主要下游途径中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、甲萘醌生物合成（基于Men家族基因框架重新注释）和叶酸生物合成在12?h上调，而铁载体非核糖体肽生物合成被显著抑制。代谢通量被选择性重定向至酪氨酸生物合成而非能耗更高的色氨酸分支，12?h时酪氨酸相关代谢物大量积累。甲萘醌生物合成通路在6?h和12?h分别较Ew上调1.8倍（p = 0.045）和5.3倍（p = 0.006），七个核心Men基因（menF、menD、menB、menC、menE、menA和menG）均被检出。结论：共培养通过“细胞周转–氮共享–分支酸代谢重定向”框架维持持续产热，其中酪氨酸积累兼具抗氧化保护、生物膜稳定和TCA回补多重功能。
3.5 模拟HTD发酵条件下的验证
在模拟高温大曲系统中，共接种体系始终表现出最高的产热性能。第4天群落分析显示，单接种组中接种菌株均未维持优势地位，而共接种组中两种接种菌株均保持可观比例。转录组水平上，50:50共接种组相对单接种组显著富集双组分系统、氮代谢、芳香族氨基酸生物合成、硫辛酸代谢和TCA循环等关键通路。D-酪氨酸（3?μM）添加实验表明，抑制分支酸向L-酪氨酸的代谢通量后，共培养产热能力受到抑制，且抑制主要出现在6?h之后的分支酸重定向阶段。结论：受控条件下鉴定的互作机制在更复杂的HTD基质中仍保持功能活性，分支酸–酪氨酸分支对产热具有实质性贡献。
五、讨论与结论
讨论部分总结： 研究人员指出，所提出的模型是基于转录组、代谢组和表型特征的推断而非直接测定的代谢速率，这并不削弱研究结论，而是界定了下一步工作的方向。未来需要结合同位素示踪与物种分辨标记分析精确量化Bacillus与Pediococcus之间的代谢通量，通过敲除、营养缺陷型或分泌突变体进行遗传验证以将各代谢分支归属至具体物种，并针对分支酸、酪氨酸和MK-7建立基于标准品的靶向定量方法。
结论部分翻译： 本研究解析了高温大曲发酵过程中Bacillus与Pediococcus协同增强呼吸产热的分子基础，填补了固态发酵系统中种间互作研究的关键知识空白。结果表明，持续产热与以Bacillus为主导、Pediococcus作为功能促进者的热诱导动态共存格局相关，二者共同奠定了稳定产热的生态基础。通过整合转录组和代谢组数据，研究人员构建了“细胞周转–氮共享–分支酸代谢重定向”框架下的代谢模型。在该模型中，热诱导的细胞周转将细胞氮释放至共享氮库供两物种共同利用，Pediococcus贡献的芳香族氨基酸生物合成支持Bacillus的呼吸产热输出。分支酸分配作为中心代谢分支节点，碳流被优先导向酪氨酸生物合成和甲萘醌形成而非能耗高昂的途径，这一分配同时增强电子传递效率以促进呼吸产热，并通过生成氧化还原活性代谢物支持抗氧化防御，从而在热胁迫下维持高代谢周转。重要的是，模拟工业大曲发酵系统的实验结果与该机制一致，表明受控共培养条件下鉴定的互作在更复杂的开放发酵环境中仍保持功能可检测性，共同构成HTD生产早期产热的合理代谢基础。这些发现深化了对开放固态发酵系统中微生物群落产热和热适应机制的理解，同时鉴定出具有实际可操作性的微生物调控靶点，为提升HTD生产的稳定性和可控性提供了支持。
