《Food Chemistry》：Characterization of covalent conjugation between rosmarinic acid and soybean proteins with different 7S/11S globulin ratios and its impact on conjugate structure and functionality
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•迷迭香酸共价结合诱导了依赖于蛋白分数的结构重排。•SP-80和SP-96表现出最高的表观迷迭香酸结合水平。•迷迭香酸增强了各样本的抗氧化性和乳化性。•迷迭香酸以样本依赖的方式改变了胃消化和肠消化。•肽组学揭示了更短的肽段和疏水性切割位点的偏移。引言大豆蛋白是最广泛使用的植物
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迷迭香酸共价结合诱导了依赖于蛋白分数的结构重排。
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SP-80和SP-96表现出最高的表观迷迭香酸结合水平。
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迷迭香酸增强了各样本的抗氧化性和乳化性。
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迷迭香酸以样本依赖的方式改变了胃消化和肠消化。
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肽组学揭示了更短的肽段和疏水性切割位点的偏移。
引言
大豆蛋白是最广泛使用的植物来源蛋白原料之一，主要由7S球蛋白（β-伴大豆球蛋白）和11S球蛋白（大豆球蛋白）组成，二者合计约占种子总蛋白含量的70%（Boehm等，2018）。在结构上，7S球蛋白是由α'、α和β亚基组成的三聚体糖蛋白，而11S球蛋白是由六个亚基组装而成的六聚体，每个亚基均由酸性多肽链和碱性多肽链通过二硫键连接而成（Hsia等，2016）。在分子水平上，这些四级结构组织的差异可能改变疏水区域和芳香区域在表面的暴露程度，而这些区域参与多酚的初始非共价结合（Jakobek，2015），同时也会影响亲核残基（如Lys、Cys和His）的可及性，这些残基可能参与随后的共价结合（Keppler等，2020）。因此，7S/11S比值的变化可能影响迷迭香酸在蛋白表面的初始定位以及潜在反应位点的可用性，尽管这种关系也可能取决于更高阶的分子堆积和聚集状态。这些分子架构和四级组装的基本差异导致不同的技术功能特性。富含7S的蛋白通常表现出更高的溶解度、更大的持水能力和更大的分子柔性，而富含11S的蛋白通常表现出更强的凝胶形成能力。然而，它们的乳化性能可能因球蛋白组成、蛋白构象和加工条件而异（Hou等，2025）。因此，迷迭香酸共价结合可能通过不同的结构途径影响这些蛋白分数的功能特性。在富含7S的蛋白中，迷迭香酸引起的表面极性变化、疏水基团暴露和分子柔性变化可能主要影响溶解度和界面吸附；而在富含11S的蛋白中，紧凑的亚基组装和分子间相互作用的修饰可能对网络形成和黏弹性行为产生更大的影响。由于迷迭香酸共价结合可以同时引入亲水性酚羟基并促进构象重排或分子间缔合，因此由此产生的功能变化的方向和幅度预计取决于蛋白组成，而非遵循统一模式（Ali等，2018；Keppler等，2020）。
迷迭香酸（RA）是一种天然多酚，含有多个酚羟基，赋予其高化学反应活性（Marchev等，2021）。作为迷迭香提取物中的主要生物活性成分，迷迭香酸为食品应用提供了监管优势，因为迷迭香提取物被广泛认为是安全的食品添加剂（Choi等，2019）。在温和碱性条件下，酚羟基的去质子化促进了迷迭香酸儿茶酚部分的氧化，形成亲电性醌中间体。这些活性中间体可以与蛋白中可及的氨基、巯基或咪唑基团发生亲核加成反应，从而促进迷迭香酸-蛋白共价加合物的形成。碱性处理还可能诱导蛋白构象重排，增加潜在反应位点的可及性，为在迷迭香酸-蛋白共价结合中使用碱性条件提供了机制基础（Keppler等，2020）。近年来，利用天然多酚对蛋白进行化学或酶促修饰已成为一种定制蛋白结构和功能性的有效策略（Ozdal等，2013）。例如，有报道指出表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与大豆蛋白分离物的共价和非共价复合可提高复合物稳定性和抗氧化性能（Zhou等，2020）。同样，咖啡酸的非共价结合也被证明可以提高大豆蛋白分离物的溶解度和功能性（Ma等，2024）。此前的迷迭香酸专项研究表明，共价结合可以改变蛋白结构和功能性。例如，碱性条件和酶介导的迷迭香酸与乳清蛋白分离物的共价结合改变了游离氨基和巯基基团的含量，并修饰了其物理化学和抗氧化特性（Ali等，2018）。此外，基于质谱的分析在肉蛋白的多个氨基酸残基上鉴定出迷迭香酸衍生的醌加合物，包括His、Arg和Lys，证明迷迭香酸共价结合取决于特定蛋白残基的可及性和局部环境（Tang等，2016）。最近，关于迷迭香酸-大豆蛋白体系的研究表明，迷迭香酸介导的共价结合可以提高大豆蛋白的抗氧化活性和乳化特性（Jin等，2025）。
除了对蛋白结构和功能性的影响之外，多酚修饰还可能对胃肠道蛋白水解产生相位依赖性影响。胃蛋白酶具有相对广泛的底物特异性，但优先切割涉及大体积疏水残基的肽键，在P1位点上倾向于切割Phe、Leu和Met等残基。相比之下，胰蛋白酶主要在Lys和Arg的C端侧切割，尽管切割效率还受到局部序列环境和蛋白构象的影响（Gaspar等，2025；Zheng等，2020）。因此，迷迭香酸引起的这些残基的暴露程度和局部微环境变化可能改变酶特异性切割位点的可及性以及由此产生的肽谱。在胃消化阶段，迷迭香酸引起的构象重排可能改变蛋白区域对胃蛋白酶的可及性，而含迷迭香酸结构与胃蛋白酶之间的相互作用可能进一步影响蛋白水解。在随后的肠消化阶段，部分水解的蛋白暴露于胰蛋白酶中；迷迭香酸相关的分子间缔合、蛋白结合迷迭香酸基团的逐步暴露或含迷迭香酸肽段的形成可能限制切割位点的可及性并影响蛋白酶活性。因此，迷迭香酸共价结合可能会增加某些蛋白分数的胃消化敏感性，同时降低其他分数的表观肠消化程度，具体取决于底物可及性与酶-多酚相互作用之间的平衡（Mylvaganam等，2025；Vyas等，2024）。
然而，先前的研究主要集中在直接修饰完整大豆蛋白分离物，主要强调多酚类型或反应条件对蛋白功能性的影响（Jin等，2025；Ma等，2024；Zhou等，2020）。相比之下，对基于大豆蛋白分数内固有结构异质性的机制解释的关注则相对有限。在实际体系中，蛋白组成和构象的差异会显著影响多酚结合位点的空间分布和修饰反应的渗透深度，从而决定随后的结构重排和由此产生的共价产物的功能特性（Jakobek，2015）。因此，在本研究中，具有不同7S/11S比值的大豆蛋白在碱性条件下与迷迭香酸进行了共价结合。通过整合多维光谱分析、分子对接模拟和基于质谱的肽组学分析，我们系统研究了蛋白组成如何调节迷迭香酸结合行为、构象重排、功能特性和体外消化行为。本研究旨在阐明依赖于蛋白组成的迷迭香酸结合、功能表现和蛋白水解降解模式之间的关系，从而为开发迷迭香酸修饰的大豆蛋白原料提供基于组分的科学依据。
章节摘要
材料
迷迭香酸（RA，纯度≥97%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。具有不同7S/11S比值的大豆蛋白提取自宁优1号、商品大豆、恒润3号和蜀护15号。具体而言，将脱脂大豆粉与去离子水按1:10（w/v）的比例混合，并用2 mol/L NaOH将pH调至8.0。混合物在碱性条件下搅拌3小时，然后在10,000 ×g下离心30分钟。收集上清液，
迷迭香酸-大豆蛋白共价结合物的形成及物理化学特性
如图1A所示，SP-80-RA和SP-96-RA的迷迭香酸结合当量分别为34.12 ± 1.09和33.69 ± 0.45 mg RA/g蛋白，均显著高于SP-22-RA（P < 0.05）。从SP-22到SP-80和SP-96迷迭香酸结合量的增加表明，相对于11S，7S的富集可能有利于迷迭香酸共价结合。这可能与两种球蛋白分数的不同分子结构有关，因为7S通常表现出相对开放的结构，
结论
本研究证明，迷迭香酸共价结合诱导了具有不同7S/11S球蛋白比值的大豆蛋白发生组分依赖性变化。与SP-22相比，具有更高7S/11S比值的SP-80和SP-96表现出最高的表观迷迭香酸结合水平，而尽管SP-115具有最高的7S/11S比值，其迷迭香酸结合水平并未进一步增加，表明最终的迷迭香酸结合水平与球蛋白组成及伴随的构象和表面特性均有关。迷迭香酸
CRediT作者贡献声明
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利益冲突声明
作者声明他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究获得中国国家重点研发计划（2025YFE0103500）、新疆生产建设兵团重点项目（2024AB052、2025DA016）、新重庆高层次人才计划（CQYC20230A03592）、外籍专家计划和天津传统食品加工技术重点实验室（24ZGSSSS00020）的资助。
沈晓竹|沈佳龙|王亦奇|霍长虹|郭心宇|刘辉|柯盛|任家宝|王冰|Chris Blanchard|Padraig Strappe|周中凯|赵国华
