胺基润滑剂暴露下啤酒厂生物膜的类群组成与功能适应：16S/18S rRNA基因扩增子与纳米孔宏基因组研究

《Food Microbiology》：Taxonomic and Functional Insights into Brewery Biofilms under Amine-based Lubricant Exposure

　　

胺基润滑剂（amine-based lubricants）广泛用于啤酒厂以减少输送系统摩擦，且常被认为具有抑菌（bacteriostatic）作用，但其对微生物生物膜（biofilms）的影响仍很大程度上未被探索。在此，研究人员将16S/18S rRNA基因扩增子测序（16S/18S rRNA gene amplicon sequencing）与基于纳米孔的宏基因组学（nanopore-based metagenomics）相结合，研究来自三个啤酒厂的喷雾喷嘴和输送带生物膜。喷雾相关生物膜以保守的革兰氏阴性菌（Gram-negative bacteria）核心类群为主，并富集与胺代谢（amine metabolism）和氧化应激响应（oxidative stress responses）相关的基因，表明其对润滑剂暴露的功能适应。相反，在灌装单元附近收集的生物膜以乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）和酵母为主，并显示出与啤酒来源底物一致的代谢特征。值得注意的是，抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）与应激相关基因呈正相关，尤其是在喷雾喷嘴生物膜中，表明在润滑剂相关应激下存在共现。总之，这些发现强调工业润滑剂作为关键生态驱动因素，塑造啤酒厂环境中的微生物群落结构和抗性谱。

研究背景：食品工业广泛使用润滑剂，覆盖输送链润滑、轴承和轴润滑以及防腐蚀等。啤酒厂、罐头厂等行业使用这些润滑剂。其组成主要优化瓶体滑动而非抗菌特性。常用润滑剂基于脂肪胺，如月桂胺或油胺，乙氧基化或未乙氧基化。月桂型脂肪链促进润滑膜快速形成，油酸型链增强膜持久性，即抗瓶体摩擦能力。尽管此类润滑剂含脂肪胺，后者被认为具有抑菌作用，但它们可能无意中创造有利于微生物粘附和生长的微环境。残留润滑剂膜，尤其在啤酒厂等潮湿工业环境中，可作为营养源和保护生态位，促进微生物生物膜发育并导致生物污损（biofouling），即生物材料在表面的不良积累。这在喷雾喷嘴用于将稀释润滑剂溶液施加到输送带的区域尤为关键，因为可导致喷嘴堵塞、润滑不一致和摩擦增加。这些故障可导致瓶破损增加，以及相关清洁时间造成的生产率下降，造成经济损失和工人安全风险。尽管存在脂肪胺，耐受甚至抗性细菌可能被选择，类似抗生素物质的情况。在此背景下，当不同抗微生物化合物共享共同细胞靶点、作用机制或进入途径时，可能出现交叉抗性（cross-resistance）。此外，当赋予多种药物抗性的基因物理连锁在可移动遗传元件（mobile genetic elements）如质粒上时，可发展共抗性（co-resistance），导致抗性性状同时传播。除经典抗生素抗性外，细菌还可通过广谱机制包括外排泵（efflux pumps）、二硫键形成酶和代谢修饰，对结构不相关的药物如重金属和生物杀灭剂如苯扎铵化合物产生耐受。这些机制通过共选择（co-selection）促进抗性基因富集。值得注意的是，含季铵化合物（quaternary ammonium compounds）的生物杀灭剂与这种共抗性模式相关。有趣的是，脂肪酸已显示与传统抗生素靶向的细菌系统相互作用，其组合可通过非经典机制降低细菌抗性。脂肪胺诱导类似效应的潜力仍未知，强调需要研究食品和饮料加工环境中的这些现象。在此背景下，为更好理解食品工业中在脂肪胺润滑剂存在下发育的微生物群落，研究人员对运行中啤酒厂的喷雾喷嘴和瓶输送带收集的生物膜进行全面分析。通过结合16S和18S rRNA基因测序与纳米孔鸟枪法宏基因组学，研究人员旨在：(i) 表征这些生物膜的分类组成；(ii) 识别优势细菌和真核属；(iii) 评估潜在抗微生物抗性基因和其他功能性状。尽管胺基润滑剂在工业环境广泛使用，但据研究人员所知，尚无可用数据涉及这些化合物耐受或抗性基因与抗生素抗性基因之间交叉抗性的可能性。这代表理解工业化学暴露如何塑造微生物抗性谱的潜在空白。通过这种方法，研究人员试图阐明啤酒厂中润滑剂产品如何塑造微生物群落，并识别参与润滑剂降解的基因，指导开发具有增强抗微生物特性的新润滑剂。

关键技术方法：研究人员采集三个不同啤酒厂中润滑剂喷雾喷嘴（12份）和输送带（22份）生物膜，同一啤酒厂在两个不同时间点进行两次采样。采用16S/18S rRNA基因扩增子测序和纳米孔宏基因组测序。宏基因组数据经MetaFlye组装、tiara区分原核/真核、prodigal和eggNOG-mapper进行基因预测与注释，Resfams和AMR-FinderPlus注释抗性基因，mag-ont流程重建宏基因组组装基因组（MAGs），GTDB-Tk分类，RAxML-ng和IQ-TREE构建系统发育树，并用Spearman相关和Cytoscape进行共现网络分析。

研究结果：
3.1 跨啤酒厂输送带和润滑剂喷雾表面生物膜的微生物组成：研究人员通过16S rRNA基因扩增子测序分析三个啤酒厂润滑剂喷嘴和啤酒瓶输送带的细菌属谱。在啤酒厂1第一次采样中，优势属为Herbaspirillum、Achromobacter、Delftia和Oryzomicrobium，但S1S2样本例外；该输送带样本采集于灌装器附近，以Lactococcus和Furfurilactobacillus为主。第二次采样中，Herbaspirillum和Delftia仍为优势属，并伴有Pseudomonas、Comamonas和Undibacterium。S2S2为喷嘴内发育良好的生物膜，丰富度高于其他喷嘴样本，以Comamonas、Pseudomonas和Klebsiella为代表。啤酒厂1两次采样共有336个属，分别占采样1和2鉴定属的74%和83%。PERMANOVA显示生物膜群落结构显著受样本类型（喷嘴对输送带）影响。啤酒厂1的UpSet图显示，除S1S2外，所有样本中持续存在5个属：Herbaspirillum、Achromobacter、Delftia、Pigmentiphaga和Aquaspirillum；Comamonas是唯一存在于所有啤酒厂1样本的属。啤酒厂2采样3和5的细菌群落变异性大于啤酒厂1，优势属包括Cupriavidus、Methylobacterium、Acidovorax、Herbaspirillum、Delftia和Lactococcus。两次采样共有499个属，分别占采样3和5总检测属的73%和60%。Hydrogenophaga、Diaphorobacter和Delftia在啤酒厂2样本中共享，但S5S1和S5S3例外，后者采集于瓶灌装器附近。nMDS分析突出S1S2、S5S1和S5S3三个样本，它们均采自瓶灌装器附近，以Lactococcus、Furfurilactobacillus、Schleiferilactobacillus和Acetobacter为特征，而缺乏啤酒厂2典型属。PERMANOVA确认采样事件和样本类型显著影响细菌群落组成。啤酒厂3有25个共享样本属，包括Achromobacter、Comamonas、Acidovorax、Acinetobacter、Methylobacterium、Agrobacterium、Delftia和Ottowia。Alpha多样性指数显示，喷雾喷嘴样本的细菌群落多样性通常低于输送带样本，反映在丰富度和Shannon指数上；喷嘴中较高生物量与增加多样性相关。宏基因组测序结合Tiara分类组装contig为真核或原核，揭示若干样本含大量真核序列。对超过5% contig预测为真核来源的样本进行18S rRNA基因扩增子测序，以更好表征真核部分。值得注意，S1S2、S5S1和S5S3虽来自不同啤酒厂，真核组成相似，均以酵母属Magnusiomyces和Dipodascus为主，真核contig超过总组装contig的50%；其他样本还鉴定到Albifimbria、Hannaella、Tremella和Xenoacremonium。结论为生物膜群落受采样事件、啤酒厂位置和样本类型影响，存在核心微生物组，靠近灌装单元样本以乳酸菌和酵母为主，与啤酒来源底物一致。

3.2 润滑剂喷雾相关群落的细菌多样性和生态相互作用：喷嘴生物膜尤为关键，因喷嘴堵塞导致润滑剂在啤酒输送带上分布不均，是瓶破损的主要因素，也可能促进输送带自身生物膜形成。研究人员通过Circos分析和共享属分析显示，喷嘴生物膜中最丰富属为Herbaspirillum、Achromobacter、Oryzomicrobium、Comamonas、Delftia、Acidovorax、Cupriavidus、Undibacterium和Pseudomonas。其中Comamonas、Delftia、Achromobacter和Herbaspirillum在所有啤酒厂所有喷嘴样本中共享，构成啤酒厂喷嘴核心细菌群落。通过Spearman相关网络分析构建喷嘴细菌属共现网络，网络包含14个模块。模块1a连接性强，密度0.256，平均度10.33，平均聚类系数0.44，主要由Achromobacter组成，该属存在于所有或5个采样点中的4个；模块2a密度0.194，含Herbaspirillum。其余模块为低连接度的孤立外围模块。来自喷嘴宏基因组的MAG中，与模块1a、2a、2b、3、4、6、7、8和11相关的一个或多个属携带编码胺氧化酶的基因。结论为核心属可能形成密集合作网络，Achromobacter和Herbaspirillum可能为功能关键种。

3.3 生物膜群落中润滑剂抗性和代谢适应的潜在决定因素：革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的细胞包膜结构差异可影响微生物对化学应激的耐受，从而塑造润滑剂暴露下的群落组成。喷嘴相关生物膜中大多数属为革兰氏阴性菌。唯一革兰氏阳性属占显著比例的样本S1S2、S5S1和S5S3采集于瓶灌装器附近，润滑剂喷雾最小或缺失。除分类选择外，研究人员在基因组水平研究润滑剂抗性和代谢适应决定因素。重建并分析喷嘴和输送带样本的MAG，以探索优势分类群的系统发育多样性、样本特异性分布以及与润滑剂化合物代谢相关的功能能力。从32个宏基因组样本重建149个MAG，去冗余后保留100个。其中7个为喷雾喷嘴生物膜特有，90个为输送带样本特有，仅3个在喷嘴和输送带间共享。差异可能因喷雾样本中中等质量MAG数量较少，归因于喷雾喷嘴初始生物量较低。最丰富MAG在输送带样本中属于Pseudomonadota和Bacteroidota，在喷嘴样本中属于Pseudomonadota。来自S5-S1和S5-S3的MAG也在S1-S2中出现。大多数啤酒厂样本MAG编码胺氧化酶，而一部分不编码，主要来自瓶灌装器附近的输送带样本S4-S1、S5-S1和S5-S3。系统发育组成显示啤酒厂特异性聚类趋势，表明微生物群落结构位点依赖。NRI指数显示啤酒厂2有显著信号（NRI=2.75），反映该环境MAG深度系统发育聚类；比较灌装样本与其他样本的NRI和NTI未检测到显著系统发育信号。结论为MAG分析显示胺氧化酶广泛存在，灌装区MAG不编码，系统发育聚类具啤酒厂特异性。

3.4 功能基因中心方法表明抗性系统选择：为理解适应含伯胺化合物润滑剂暴露的代谢性状，研究人员首先观察胺氧化酶基因的存在。这些酶催化伯胺氧化脱氨，转化为相应醛，并产生铵（NH₄⁺）和过氧化氢（H₂O₂）。由于形成反应性副产物，微生物适应可能需要额外基因编码氧化应激响应蛋白（如过氧化氢酶、过氧化物酶）以及铵同化和解毒相关酶。靠近瓶灌装单元、润滑剂应激较少的样本，其微生物群落组成和代谢通路谱显著不同。nMDS分析显示，这些差异在完整注释基因集、抗生素抗性相关基因、以及其他应激抗性因子（金属、热、毒力、生物杀灭剂、酸）中一致。为研究不同润滑剂暴露水平下代谢策略变化，研究人员分析Sampling 5，因该采样包含从高度润滑输送带区域（S5S2、S5S7、S5S8）到最小润滑剂暴露灌装区（S5S1、S5S3）的梯度，可减少位置和采样相关变异。研究检测伯胺降解、铵吸收（如谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合酶（GS-GOGAT）循环、谷氨酸脱氢酶（GDH）和铵转运蛋白amt）以及啤酒化合物代谢（如麦芽糖转运和分解、同型和异型发酵、乙醇降解）相关通路。还筛选氧化和膜应激相关应激响应系统，包括sigma因子、硫氧还蛋白系统、外膜蛋白（OMPs）、氧化DNA修复机制和脂多糖生物合成通路，基于KEGG Orthology（KO）注释推断功能存在。结果显示，靠近瓶灌装样本S5S1和S5S3的胺氧化酶水平低于喷嘴和输送带样本。sigma因子调节和氧化应激响应基因相对丰度在喷嘴和输送带样本高于啤酒接触表面。这些群落显示麦芽糖转运、麦芽糖降解和异型发酵代谢基因丰度更高，与啤酒中麦芽糖和其他可发酵糖一致。喷嘴和输送带群落富集GS-GOGAT代谢基因，参与氨同化（NH₄⁺），后者是胺氧化酶处理胺化合物的潜在降解产物。进一步分析ARGs、应激相关基因和胺氧化酶之间的关系，以研究润滑剂暴露与抗性基因出现或持续的潜在联系。喷嘴样本中ARGs与其他应激相关基因（金属、生物杀灭剂、酸、热、毒力）相对丰度呈显著正相关（R²=0.594），而输送带样本相关性弱得多（R²=0.128），表明ARGs与应激相关基因的关联可能特异于喷雾喷嘴。此外，胺氧化酶基因与ARGs相对丰度无显著相关（R²=0.106）。这些分析基于宏基因组测序的RPKM，相关性突出潜在共现模式和功能耦合，反映相对序列表示而非绝对基因拷贝数。结论为喷雾喷嘴是更强应激微环境，选择抗性和应激适应基因；胺氧化酶本身与ARGs无直接相关。

讨论部分总结：4.1 核心和位点特异性生物膜群落：16S rRNA基因扩增子测序确定细菌属水平谱，显示细菌群落组成随采样事件、啤酒厂位置和样本类型变化，PERMANOVA支持。采样事件影响此前已显示与季节有关；啤酒厂位置影响可能反映局部环境条件。一些属跨多个啤酒厂和采样事件一致，包括Herbaspirillum、Achromobacter、Delftia、Acidovorax和Pseudomonas，提示核心微生物组（core microbiome）存在。这些属以代谢多能性和形成生物膜能力著称。Herbaspirillum为植物促生根际细菌（PGPR），可能促进植物氮营养，并报告可降解农药、烃和除草剂等异生物质；Delftia也与PGPR相关，能同化氨，并用于有毒有机化合物生物修复；Achromobacter产生物表面活性剂并降解烃；Pseudomonas代谢多能。靠近灌装区样本S1S2、S5S1和S5S3以乳酸菌如Lactococcus、Furfurilactobacillus和Schleiferilactobacillus为主，提示与其他区域不同的群落组装过程。潜在污染可能来自产品本身或该加工阶段特定微环境，可能涉及啤酒残留、飞溅或可发酵底物。啤酒酸性pH（3.8-4.7）、乙醇和有限营养创造选择环境，有利于耐酒花乳酸菌；高丰度酵母可补偿营养限制。乳酸菌是酿造工业主要关注对象，其增殖可导致酸败、浑浊和异味。乳酸菌通过发酵代谢啤酒中糖，主要产乳酸或乳酸、乙醇、CO₂和乙酸混合物；其适应酸性环境使其适合定殖和持续存在于啤酒等发酵饮料。先前研究表明工业表面如地板和包装区显示更高乳酸菌多样性，包括常在麦芽汁和啤酒环境中发现的分类群。Acetobacter也常见，是葡萄酒、苹果酒或啤酒的常见污染菌，为醋酸菌，化能有机营养，在pH 4-6利用乙醇、葡萄糖和甘油。与此一致，生物膜S1S2、S5S1和S5S3显示较低pH值，分别为5.0、3.5和5.0。真核组成上，这些样本以酵母属Magnusiomyces和Dipodascus为主，与富糖环境相关；真核contig占组装contig超过50%，表明真核显著贡献，但基于contig计数的丰度估计为半定量，解释需谨慎，因组装偏差和基因组大小差异可能影响表观相对丰度。

4.2 喷雾相关生物膜中细菌相互作用和潜在关键种：喷雾喷嘴是啤酒厂操作关键点，其正常功能直接影响润滑剂沿啤酒输送带均匀分布。堵塞或故障导致润滑不均，增加机械应力，是瓶破损主要因素，因此研究特别关注喷雾喷嘴样本。细菌群落中Comamonas、Delftia、Achromobacter和Herbaspirillum持续存在于所有不同啤酒厂喷嘴样本，代表与啤酒厂喷雾喷嘴相关的核心细菌群落。共现网络分析推断相互作用，形成最密集连接簇（模块1a）的属在几乎所有采样点检测到，表明这些分类群可能在不同啤酒厂环境中参与反复且潜在合作相互作用。此外，核心细菌喷雾喷嘴相关群落中的Herbaspirillum和Achromobacter不在同一模块，提示这些核心属塑造不同细菌组装，可能反映功能角色差异，如Herbaspirillum的固氮和内共生相互作用，而Achromobacter降解复杂有机化合物，或对特定环境因素如pH、温度的差异响应。在喷嘴宏基因组数据集重建的MAG中，核心属Achromobacter和Herbaspirillum分布在大多数模块，并携带编码胺氧化酶的基因，这些酶参与伯胺降解，提示这些分类群在适应润滑剂环境中起核心作用，可能积极参与含氮润滑剂化合物分解，促进生物膜内营养循环。其代谢能力也可能促进群落内代谢互补和合作，尤其在高度连接模块如1a和2a，密集相互作用网络表明相关细菌属间更强合作潜力。因此，Achromobacter和Herbaspirillum可能作为功能关键种（functional keystone species），塑造其微生态位化学条件和微生物群落整体结构与稳定性。

4.3 生物膜群落对润滑剂暴露的功能适应：首先，革兰氏阴性菌优势可能反映润滑剂暴露下的选择优势。革兰氏阴性菌有外膜作为渗透屏障，抵抗润滑剂配方中常见疏水化合物如脂肪酸和非离子表面活性剂；革兰氏阳性菌缺乏外膜，通常更易感，因肽聚糖丰富的细胞壁更渗透。这对饱和脂肪酸和脂肪胺已有充分记录，它们对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性病原体有强抗菌活性。结构和生化差异可能解释喷雾相关生物膜中革兰氏阴性MAG普遍，润滑剂残留暴露最高；革兰氏阳性属在靠近瓶灌装样本中更丰富，润滑剂喷雾最小或缺失，确认润滑剂暴露相关环境应激是塑造细菌群落结构的关键因素。系统发育树支持该假设：来自S5-S1和S5-S3的MAG也存在于S1-S2，来自啤酒灌装单元，提示啤酒残留创造相似生态位，促进不同啤酒厂相同微生物物种生长；这也支持其他样本MAG中胺氧化酶的存在可能源于润滑剂暴露施加的选择压力，因这些酶可能参与润滑剂中含胺化合物降解。部分MAG跨啤酒厂混合，可能反映共享生态位或机会性细菌存在。与啤酒厂1和3无显著系统发育聚类相比，啤酒厂2显示显著NRI，表明该设施微生物谱系比随机预期更密切相关，提示局部环境条件强烈选择特定深度谱系，或微生物周转有限；环境过滤可能源于pH、温度或残留啤酒成分等理化因素，favor适应这些条件的分类群；或者通过原料、空气或设备引入新微生物分类群较少，促成已建立谱系优势，加强系统发育聚类；特定微生物相互作用如竞争排斥或合作网络也可能稳定这些谱系在生物膜中的存在。这些发现强调即使在相似工业环境中，局部条件差异可导致微生物群落组装和系统发育结构显著变化。为更好理解润滑剂暴露如何塑造生物膜内微生物功能，研究伯胺降解、铵同化、氧化应激响应系统和啤酒衍生化合物代谢相关通路。润滑剂相关样本中sigma因子调节和氧化应激响应基因丰度高于啤酒接触表面，可由代谢背景解释：细菌利用胺氧化酶降解润滑剂中胺基化合物可能产生过氧化氢（H₂O₂）作为副产物，导致氧化应激升高。相反，靠近瓶灌装器的微生物群落更可能接触啤酒残留，似乎依赖替代碳源，这得到参与麦芽糖摄取和降解（如麦芽糖转运蛋白和麦芽糖分解酶）以及乙醇氧化和降解相关基因存在的支持。这些代谢性状提示利用啤酒残留中糖和乙醇的能力，可能反映与丰富周围微生物群落的代谢相互作用。总之，结果提示基于采样位置的清晰代谢分化：啤酒暴露环境细菌群落优先代谢啤酒衍生碳水化合物如麦芽糖，而更多暴露润滑剂的群落依赖替代氮源并表现增加氧化应激响应。啤酒厂微生物群落结构受不同局部环境力量支配：靠近灌装单元样本S1S2、S5S1和S5S3中，低pH（3.5–5.0）和丰富啤酒衍生可发酵碳水化合物作为主要选择过滤器，驱动耐酸乳酸菌和酵母富集；相反，在喷雾喷嘴和主要输送带区域缺乏可见啤酒污染，暴露胺基润滑剂是主要生态驱动因素，选择具有胺降解和氧化应激响应通路的革兰氏阴性分类群。最后，评估喷雾和输送带相关生物膜中ARGs、应激相关基因和胺氧化酶之间的潜在共现。观察到ARGs和应激相关基因正相关，喷雾中比输送带更强，提示这些区域微生物群落可能共选择抗微生物抗性和一般应激耐受性状；喷雾相关生物膜中更强相关表明这些位置可能代表更有应激微环境，从而相比输送带施加更强选择压力用于抗性和应激适应基因。先前研究表明各种环境应激可促进抗性决定子共选择，特别是ARGs和金属抗性基因之间的关联；相反，未观察到ARGs出现与携带胺氧化酶或脱氢酶细菌存在之间的显著关联，提示观察到的选择可能主要是组成性的，反映革兰氏阴性菌普遍和更广泛微生物群落携带胺氧化酶活性。

结论翻译：这项研究首次深入表征工业啤酒厂环境中暴露于润滑剂的微生物群落，使用16S/18S rRNA基因扩增子测序和宏基因组分析相结合。结果表明，润滑剂喷雾喷嘴和输送带表面拥有不同的细菌组合，由其特定理化环境塑造。直接暴露于胺基润滑剂的喷雾喷嘴生物膜以革兰氏阴性属为主，并富集与氧化应激响应和胺代谢相关的基因，特别是胺氧化酶。这些发现提示这些微生物群落对润滑剂衍生化合物的生态和代谢适应，这些化合物可能既作为应激源也作为碳/氮源。相反，靠近灌装单元收集的样本，可能更多受啤酒残留影响，以乳酸菌和酵母为主，并显示参与麦芽糖转运、异型发酵和啤酒化合物利用的基因丰度增加。这种代谢分歧突出润滑剂暴露或啤酒接触施加的选择压力，导致同一工业环境中空间上不同的微生物生态型。此外，相关性分析揭示抗生素抗性基因与应激相关基因之间的位置特异性关联，特别是在喷嘴相关生物膜中。这种模式支持共现假设，即反复暴露于生物杀灭剂和润滑剂相关化合物可能favor应激耐受和潜在抗生素抗性细菌的富集。然而，未发现胺氧化酶丰度与ARGs之间的直接相关，提示仅润滑剂降解不是抗性出现的主要驱动因素。为补充这些宏基因组见解，未来研究应纳入靶向培养依赖分离策略，利用专用最小培养基富集润滑剂作为唯一碳氮源，成功分离核心分类群如Herbaspirillum或Achromobacter。后续体外试验，包括微孔板生物膜形成、润滑剂耐受性和MIC测定，将提供有价值的补充工具，进一步表征与计算机模拟识别的功能适应相关的表型机制。总体而言，这些发现强调润滑剂影响环境中环境应激源、微生物适应和抗性基因动态之间的复杂相互作用。这些见解为开发更有效生物膜控制策略铺平道路，包括润滑剂重新配制或整合靶向抗微生物功能，以限制食品生产设施中微生物定殖。