TMEM63B机械敏感通道参与背根神经节伤害性热觉感知的脂质依赖性调控机制

《PLOS Biology》：The mechanosensitive channel TMEM63B contributes to noxious heat sensation in the dorsal root ganglia

　　

：在哺乳动物中，热觉感知主要由背根神经节（DRG）神经元中的热敏感通道介导，尤其是瞬时受体电位（TRP）通道。然而，是否存在其他通道参与伤害性热觉检测仍不清楚。本研究探讨了机械敏感阳离子通道TMEM63B在DRG神经元中的作用，并意外发现其参与伤害性热觉感知而非机械感知。TMEM63B在DRG神经元中广泛表达，其全身性敲除或DRG特异性条件性敲除均显著降低热敏感性。TMEM63B缺失显著减弱了DRG神经元中热诱导的钙离子（Ca2+）反应和电流，并提高了动作电位（AP）激发的温度阈值。重组TMEM63B在钙成像实验中表现出中等程度的热反应。值得注意的是，在花生四烯酸（AA）存在下，TMEM63B被热刺激强烈激活，提示其热敏感性受膜脂质环境调控。综上所述，这些发现将TMEM63B鉴定为一种参与热觉感知的新型通道，并揭示了其通道活性的脂质依赖性调控机制。

论文解读

一、研究背景与科学问题

伤害性感受是机体抵御损伤的重要保护机制。伤害性刺激由背根神经节（DRG）中的初级感觉神经元检测，通过脊髓背角次级神经元传递至中枢神经系统。目前已鉴定出众多参与伤害性感受的分子组分：经典热传感器TRPV1可响应热刺激及质子、辣椒素等化学物质；其他热敏感TRP通道如TRPV4、TRPM2和TRPM3也参与温觉和热觉检测；TRPM8和TRPA1介导冷觉；机械性疼痛和轻柔触觉主要由Piezo2传导。值得注意的是，多种受体常共同参与单一伤害性刺激的检测。例如，TRPV1、TRPM3和TRPA1均被证实参与伤害性热觉感知，但敲除这三种通道的小鼠仍能回避伤害性热刺激，表明存在其他热传导的分子组分。当药理学阻断TRPV1、TRPM3和TRPA1后，TRPM2缺失可进一步减少热响应DRG神经元的数量。此外，钙激活氯通道ANO1和TMC6也被报道参与伤害性热觉调节。这种看似冗余的机制可能确保动物在不同环境背景下对伤害性热刺激保持警觉。

TMEM63B是近年来发现的一种非选择性阳离子通道，对单价阳离子Na⁺、K⁺及二价阳离子Mg²⁺和Ca²⁺具有通透性。该通道具有渗透敏感性，可被机械刺激激活，并作为脂质翻转酶调节细胞膜或细胞器膜上的磷脂分布。在既往研究中，TMEM63B被证实对听觉功能至关重要，其敲除可导致耳蜗外毛细胞缺失而引发耳聋；在肺泡II型上皮细胞中感知吸气诱导的机械牵张并调节肺表面活性物质分泌；还参与甲状腺激素分泌和胰岛素释放等内分泌信号调控。在中枢神经系统中，TMEM63B作为渗透压传感器在内感受神经元中发挥口渴感知的关键作用。鉴于TMEM63B在耳蜗螺旋神经节神经元中高表达，研究人员推测其可能广泛表达于DRG等感觉神经节并参与躯体感觉。

二、研究设计与主要结论

本研究通过系统性的基因表达分析、行为学测试、钙成像、电生理记录和异源表达实验，揭示了TMEM63B在DRG神经元伤害性热觉感知中的全新功能。研究人员发现TMEM63B广泛表达于DRG各类感觉神经元亚群，其缺失特异性损害伤害性热觉感知而不影响机械痛觉和冷觉。TMEM63B缺失显著减弱热诱导的Ca²⁺反应和电流密度，并提高动作电位激发的温度阈值。重组TMEM63B在异源系统中表现出较弱的热敏感性，但花生四烯酸可显著增强其热反应和渗透反应，揭示其热敏感性受膜脂质环境调控。该研究鉴定TMEM63B为独立于TRPV1、TRPM3和TRPA1的新型热觉传导分子，为理解伤害性热觉感知的分子冗余机制提供了新视角。

三、关键技术方法

研究人员主要运用以下关键技术方法开展研究：利用Tmem63b^HA-fl小鼠进行HA标签免疫荧光染色分析TMEM63B在DRG神经元的表达分布；通过全身性基因敲除和Advillin-Cre介导的DRG特异性条件性敲除小鼠模型进行行为学测试，包括热板实验、甩尾实验、Hargreaves实验、四温度选择实验、von Frey纤维丝实验和刷触实验；采用Fluo-4 AM钙成像技术检测DRG神经元热诱导的Ca²⁺信号变化；运用全细胞膜片钳电生理记录分析热诱导动作电位发放和电流变化；在N2a细胞中异源表达TMEM63B结合GCaMP6f钙成像和膜片钳记录验证其热敏感性和花生四烯酸调控作用。

四、研究结果

（一）TMEM63B广泛表达于初级感觉神经元

利用Tmem63b^HA-fl小鼠的HA免疫染色分析显示，TMEM63B在54%的DRG神经元中表达，显著分布于小、中、大型DRG神经元。定量共定位分析表明，TMEM63B在约一半的CGRP阳性肽能神经元和IB4结合非肽能神经元中表达，这两类是无髓鞘C纤维伤害性感受器的主要类别。TMEM63B还在65.96%的NFH阳性大直径有髓鞘感觉神经元中广泛表达。值得注意的是，59.38%的TRPV1阳性伤害性热感受器表达TMEM63B。此外，在脊髓背角初级传入纤维的中枢末梢也观察到HA-TMEM63B与CGRP的共定位。

（二）Tmem63b敲除小鼠对急性伤害性热刺激敏感性降低

行为学分析显示，Tmem63b^?/?小鼠对无害刷触刺激的反应呈非显著性降低趋势，von Frey纤维丝定量测试表明敲除动物的无害和伤害性机械刺激退缩反应均正常，提示TMEM63B对基础机械性疼痛感知并非必需。在热板测试中，Tmem63b^?/?小鼠在50、53和56°C时表现出受损的伤害性反应，但对?5°C冷板的反应正常。甩尾实验中，Tmem63b^?/?小鼠对热水表现出显著延长的退缩潜伏期。Hargreaves测试同样显示敲除小鼠回避行为受损。这些一致的仅在热觉而非机械或冷觉反应中的表型缺陷，强烈提示TMEM63B参与伤害性热觉感知。DRG特异性条件性敲除小鼠在热板、甩尾和Hargreaves测试中均表现出延迟的伤害性反应，四温度选择实验显示cKO小鼠在43°C和48°C高温区域的停留时间显著增加，证实DRG神经元中的TMEM63B对正常伤害性热觉感知是必需的。

（三）TMEM63B缺失损害DRG神经元热诱导Ca²⁺信号

钙成像实验表明，在43°C和46°C热刺激下，Tmem63b^?/?小鼠DRG神经元中热响应神经元的比例和Ca²⁺升高的幅度均显著低于对照组。在43°C时，约27%的Tmem63b^?/?DRG神经元表现出Ca²⁺升高，显著低于Tmem63b^+/?神经元的约42%。KCl响应神经元比例和KCl诱导的钙瞬变幅度在两组间无差异，确认TMEM63B缺失特异性影响热敏感性而非神经元整体健康。在TRPV1、TRPM3和TRPA1拮抗剂混合物存在下，TMEM63B缺失仍显著降低热诱导的Ca²⁺升高，表明TMEM63B独立于这些经典TRP通道参与热感知。

（四）TMEM63B缺失减弱DRG神经元热诱导电生理反应

电生理记录显示，部分对照神经元在温度达到37°C时即开始发放动作电位，而cKO DRG神经元在温度达到43°C前很少观察到AP。TMEM63B-cKO神经元热诱导AP的平均热激活阈值升高约1.5°C。在41°C至44°C热刺激范围内，TMEM63B缺失显著降低了热兴奋DRG神经元的百分比。TMEM63B缺失主要降低了41至43°C之间的放电频率。静息膜电位不受TMEM63B缺失影响，提示DRG神经元中TMEM63B的基础活性较低。在药理学阻断主要热敏感TRP通道的条件下，DRG神经元仍表现出热诱导电流，但cKO小鼠DRG神经元的电流密度显著低于对照组，且电流达到平台期的温度更高。这些结果提供了TMEM63B独立于TRPV1、TRPM3和TRPA1贡献热敏感电流的直接电生理证据。

（五）重组TMEM63B表现出脂质依赖性热敏感性

在N2a细胞中异源表达TMEM63B并结合GCaMP6f钙成像发现，46°C热刺激仅诱导非常温和的Ca²⁺升高。经40μM花生四烯酸预处理后，伤害性热刺激在TMEM63B转染细胞中诱导了强烈的Ca²⁺升高。低于20μM的AA浓度对热诱导钙信号影响甚微，而超过40μM的浓度一致性地增强了TMEM63B介导的46°C刺激钙反应。在恒定AA浓度下，Ca²⁺荧光随加热温度升高而增加，且可被广谱多价阳离子孔道阻断剂La³⁺消除。ETYA作为AA不可代谢的类似物，不仅未拮抗AA的作用反而增强了热诱导的Ca²⁺信号，表明AA通过其自身分子特性而非下游代谢产物增强TMEM63B活性。在室温下，AA在TMEM63B转染细胞中未诱导可检测的Ca²⁺信号，提示AA主要作为敏化剂而非直接激动剂。全细胞膜片钳记录证实，在40μM AA存在下，热诱导电流在TMEM63B表达细胞中显著增强，且可被钌红阻断。TMEM63B与TRPV1、TRPM3或TRPA1共表达并不增强这些通道的激动剂诱导电流，排除其通过增强已知热TRP通道发挥作用的可能性。AA同样增强TMEM63B的渗透敏感性，进一步支持其脂质调控机制。

五、讨论与结论

本研究将TMEM63B鉴定为DRG神经元中介导伤害性热觉感知的重要分子组分。支持证据包括：TMEM63B在DRG神经元亚群中广泛表达；基因消融损害对伤害性热刺激的行为反应但不影响机械性疼痛；TMEM63B缺失降低热诱导Ca²⁺信号和电流密度并提高DRG神经元动作电位阈值；重组TMEM63B表现出温和的热敏感性且可被AA增强。

TMEM63B在异源系统中的直接热敏感性较弱，但在超过40μM的AA浓度下被显著增强。尽管完整组织中游离AA的基础水平通常为亚微摩尔范围，但AA的发现代表了促进TMEM63B热敏感性和渗透敏感性的脂质微环境。TMEM63家族通道的激活机制尚不完全清楚，结构研究揭示OSCA/TMEM63激活关键依赖于蛋白质裂隙内的脂质相互作用，力诱导的磷脂重组可能作为调控开关。研究人员提出工作假说：TMEM63B通道的热激活可能通过热驱动的脂质-蛋白质相互作用扰动实现，最终促进通道开放。异源表达系统可能缺乏最佳膜脂质微环境或关键结合伙伴，这或可解释重组TMEM63B热敏感性较弱的现象。

尽管TMEM63B最初被表征为机械和渗透敏感阳离子通道，但本研究未观察到WT和Tmem63b^?/?小鼠之间机械性疼痛敏感性的差异，表明DRG中的TMEM63B在基础条件下不介导伤害性机械感知。鉴于DRG神经元的异质性和TMEM63B的广泛表达，其可能在亚群特异性机械感知过程中发挥作用。

本研究存在以下局限性：支持TMEM63B直接热敏感性的证据有限，在异源表达系统中仅观察到非常温和的热响应；当前实验无法区分AA是通过调节膜特性还是通过更直接的结合机制增强TMEM63B；虽然cKO模型强调了DRG表达的TMEM63B在伤害性热觉感知中的重要作用，但需要细胞类型特异性拯救实验进一步阐明DRG特异性缺失TMEM63B与热觉受损之间的因果关系。

综上所述，本研究鉴定TMEM63B为一种新型热觉传导通道，揭示了其通道活性的脂质依赖性调控机制，为理解伤害性热觉感知的分子冗余机制和脂质环境对通道功能的调控提供了重要见解。