用于高级别浆液性卵巢癌的免疫亲和富集细胞外囊泡蛋白质组学——一项UKOPS巢式病例对照分析

《Gynecologic Oncology》：Immunoaffinity-enriched extracellular vesicle proteomics for high-grade serous ovarian cancer - A UKOPS nested case-control analysis

　　

摘要

目的

确定血浆和血清中的细胞外囊泡（EV）在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）免疫亲和富集蛋白质组学检测中是否可以互换使用，以及EV蛋白质特征是否能超越CA-125提高卵巢癌的诊断性能。

方法

我们对英国卵巢癌人群研究（UKOPS）的嵌套病例对照队列中243对EDTA血浆和血清样本的EV亚群进行了免疫亲和富集蛋白质组学检测。分析评估了蛋白质组学深度、血浆与血清的一致性，并使用机器学习评价诊断性能。

结果

血浆来源的EV亚群比血清表现出更大的蛋白质组学深度，鉴定出6439个与5451个蛋白质组，分别在50%流行率下检测到2838个与840个蛋白质。不同基质间的蛋白质丰度高度一致（r = 0.86，p < 0.001），并在各疾病组和癌症分期中保持一致。在区分HGSOC与非癌患者方面，EV增强的CA-125模型在血浆中AUROC达到0.97，在血清中达到0.96，将血浆灵敏度提高至99%（95% CI 89–100）、特异度提高至85%（95% CI 68–91），而单用CA-125的灵敏度为96%（95% CI 82–100）、特异度为65%（95% CI 15–73），血清中同样表现出高度区分能力。

结论

表面表位靶向的EV亚群富集可实现HGSOC的特异性蛋白质组学检测，且血浆和血清间具有高度一致的生物标志物特征，支持其在临床和生物样本库中互换使用。EV增强的CA-125模型优于单用CA-125，反复出现的EV蛋白反映了黏蛋白介导的免疫逃逸和代谢重编程，突显了该方法在血液检测卵巢癌方面的转化潜力。

引言

卵巢癌仍是最致命的妇科恶性肿瘤，由于诊断较晚，五年生存率不足50%[1]。大多数患者在出现转移扩散且治疗选择有限时才被发现患有晚期疾病[2]。早期检测可显著改善预后，但目前筛查方法缺乏足够的灵敏度和特异度[3]。

细胞外囊泡（EV）已成为丰富的生物标志物来源，相较于传统液体活检方法具有优势[4]。这些膜封闭的纳米颗粒携带多样化的分子货物，包括蛋白质、核酸、脂质、代谢物等，反映了其来源细胞的信息。在癌症中，EV参与肿瘤进展、转移、免疫逃逸和药物抵抗，使其分子内容具有重要的信息价值[5]。关键在于，脂双层结构保护EV内货物免受降解，相较于游离核酸或可溶性蛋白质，其分析物稳定性更强[6]。

大多数EV分离方法，包括超速离心、尺寸排阻色谱和聚合物沉淀法，按大小、密度或电荷分离囊泡，但往往产生异质性较高的制剂且可重复性有限，这可能掩盖具有诊断意义的亚群，且难以在病理实验室中标准化常规使用[7]。这些总体制剂方法还可能稀释组织特异性EV的信号，而这些EV更可能携带特定的疾病信息。相比之下，靶向EV表面表位的免疫亲和方法可实现具有生物学定义的EV亚群富集，增强分析特异性和临床可解释性[8]。从总体EV制剂到利用适用性方法进行亚群水平分析的概念转变，越来越被认为对下一代诊断工具的开发至关重要[9]。

一个基本问题涉及血浆与血清在EV相关生物标志物研究中的等效性。全球生物样本库中保存了在不同方案下采集的两种样本类型。血浆保留凝血因子；血清是凝血后、血小板激活和纤维蛋白原消耗后剩余的液体[10]。因此，样本处理可能影响EV亚群和生物标志物可检测性。先前的比较研究结果相互矛盾[11]。确立EV亚群分析的可互换性将扩展对存档临床样本的获取并促进多中心验证。

一种靶向保守EV表面标志物的免疫亲和磁珠（IMB）系统，可实现与临床工作流程兼容的快速、可重复富集[12]。高分辨率质谱仪（Orbitrap Astral，ThermoFisher）提供极高的灵敏度，可在20分钟梯度中鉴定出超过8500个蛋白质组[13]。因此，我们假设IMB捕获EV在血浆和血清中捕获具有诊断意义的EV亚群的性能是等效的。在本研究中，我们分析了临床卵巢癌生物样本库研究的配对样本，进行了全面的蛋白质组学检测，量化了基质间的一致性，并使用机器学习评价了诊断性能。我们的发现表明，表面表位靶向的EV亚群富集在不同基质中产生高度一致的生物标志物特征，支持它们的互换使用。

章节摘要

方法

所有实验均在通过ISO17025认证的设施中进行，数据记录在符合21 CFR Part 11的电子笔记本中。本研究遵循《赫尔辛基宣言》；获得了昆士兰大学（2023/HE002226）和UCL研究伦理委员会（22,333.001）的伦理批准，所有参与者均签署书面知情同意书。UKOPS生物样本库的伦理批准由伦敦大学学院/联合

研究人群与配对样本特征

图1展示了从UKOPS中选择卵巢癌病例和对照组的方案设计。UKOPS队列包含4823名女性，其中1200例卵巢癌病例和3623例对照。从该队列中选择配对的血浆和血清样本，以评估高级别浆液性卵巢癌（HGSOC；n = 80）、交界性浆液性上皮癌（n = 20）、良性浆液性卵巢

主要结果摘要

本研究提供了两项主要发现。免疫亲和EV多蛋白特征在所有具有临床意义的成对比较中均显著优于单用CA-125，且在血浆和血清中均如此。尽管血浆提供3.4倍更大的蛋白质组学深度，但定量蛋白质丰度和诊断性能指标在基质间高度一致，证实血浆和血清在免疫亲和EV亚群蛋白质组学中基本可互换使用。

已发表文献背景下的结果

EV

结论

免疫亲和富集EV亚群可从血浆和血清中进行HGSOC的深度、生物学特异性蛋白质组学检测。尽管血浆提供3.4倍更大的蛋白质组学深度，但强烈的定量一致性（r = 0.86）和等效的诊断性能（AUROC 0.97 vs 0.96）证实两种基质均可互换用于EV生物标志物发现和分类。EV增强的CA-125模型显著优于单用CA-125，反复出现的蛋白

作者贡献声明

Carlos Salomon：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，资源，项目管理，方法学，调查，资金获取，形式分析，数据整理，概念构思。Andrew Lai：可视化，方法学，调查，形式分析。Dominic Guanzon：可视化，方法学，形式分析。Katherin Scholz-Romero：方法学，调查。Nihar Godbole：方法学，调查。Carlos Palma：调查。Sophia Apostolidou：

资金

本工作由医学研究未来基金（MRF1199984）、国家健康与医学研究委员会（NHMRC 1195451）、Donald & Joan Wilson基金会有限公司（2020000323）和卵巢癌研究基金会（OCRF，2018001167）资助。UKOPS生物样本库由The Eve Appeal（The Oak Foundation）资助。UM和AG-M均从英国医学研究委员会核心基金拨款MC_UU_00004/01获得薪资支持。

利益冲突声明

EXO-NET平台及相关知识产权处于专利申请阶段。G.R.是INOVIQ Ltd.的创始科学家和顾问，该公司开发基于EV的诊断产品。C.S.是INOVIQ Ltd.医学与科学咨询委员会成员。UM报告来自Intelligent Lab on Fiber、RNA Guardian、MercyBio Analytics和CleoDx的机构研究支持拨款，与卵巢癌早期检测相关。UM、SA和AGM报告来自Mercy的个人咨询费

致谢

作者衷心感谢WEHI蛋白质组学中心在本工作中的支持与协助。我们亦对所有参与英国卵巢癌人群研究（UKOPS）并慷慨捐赠血液样本的女性表示诚挚感谢，没有她们的贡献，本研究将无法实现。

Carlos Salomon|Andrew Lai|Dominic Guanzon|Katherin Scholz-Romero|Nihar Godbole|Carlos Palma|Sophia Apostolidou|Aleksandra Gentry-Maharaj|Gregory E. Rice|Usha Menon

转化外泌体在产科与妇科肿瘤学中的应用小组，Frazer研究所，健康、医学与行为科学学院，昆士兰大学，布里斯班，昆士兰州4072，澳大利亚