重新审视合成ORF序列对工程化LINE-1逆转座的影响——ORF1p变异与3′UTR富含鸟苷酸区（GRR）的关键作用

《PLOS Genetics》：Revisiting the impact of synthetic ORF sequences on engineered LINE-1 retrotransposition

　　

逆转座子长散在核元件-1（Long Interspersed Element-1, L1）包含富含腺苷酸的开放阅读框（open reading frames, ORFs），这一特征限制了其在哺乳动物细胞中的表达。一种ORF腺苷酸含量从40%降至26%的合成小鼠L1（synthetic mouse L1, smL1）表现出mRNA表达增加，并且逆转座效率远高于天然亲本元件L1spa。在本研究中，研究人员观察到L1spa与smL1的ORF1序列之间存在两个非同义替换，并注意到smL1的3′UTR缺少一个保守的富含鸟苷酸区（guanosine-rich region, GRR），该区域可能形成G-四链体（G-quadruplex）二级结构。研究人员发现，ORF1p氨基酸序列的改变与GRR 3′UTR缺失的联合效应，而非合成ORF序列，是smL1逆转座效率高于L1spa的原因。研究人员确定，GRR的存在以位置依赖性方式影响天然小鼠L1逆转座，且该影响不涉及L1 mRNA转录本的提前多腺苷酸化或L1插入结构的改变。相反，研究人员提供的证据表明，GRR对天然小鼠逆转座的位置依赖性效应是通过调节L1 ORF1p丰度实现的。相比之下，smL1逆转座对GRR的抑制效应不敏感，这很可能归因于合成ORF序列介导的高效蛋白表达。综上，本研究结果促使进一步探究GRR序列与L1蛋白表达之间的关系，并证明报告构建体中L1核苷酸序列的排布可影响L1表达及工程化逆转座效率。

长散在核元件-1（Long Interspersed Element-1, L1）逆转座子是哺乳动物基因组中持续存在的突变源。小鼠基因组中约含3000个具有逆转座能力的L1（retrotransposition-competent L1s, RC-L1s），分属L1_TF、L1_GF和L1_A三个亚家族，各亚家族以其携带启动子的单体5′UTR相区分。RC-L1s编码两种移动所需蛋白：ORF1p（核酸结合与伴侣蛋白）和ORF2p（具有内切酶和逆转录酶活性，通过靶标引发逆转录（target-primed reverse transcription, TPRT）生成新插入）。L1 3′UTR含有弱多腺苷酸化信号和一个跨物种保守的poly-purine区。约1/8小鼠和1/62.5人类携带de novo L1插入，且超过100例人类遗传病和众多小鼠自发突变与L1逆转座相关。单个L1拷贝的逆转座效率可在培养细胞中通过逆转座指示实验评估。

此前，Boeke和Han开发了合成小鼠L1（synthetic mouse L1, smL1），通过同义替换将L1spa的ORF腺苷酸含量从40%降至26%，使其mRNA表达显著升高，在HeLa细胞中逆转座效率比天然L1spa（pTN201/L1spa）高约200倍；然而，类似策略构建的合成人类L1仅比天然元件提高至多3倍。这一矛盾提示，合成ORF序列并非smL1高效逆转座的唯一原因。研究人员对smL1和pTN201/L1spa质粒进行毛细管测序和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序后发现，除合成ORF序列外，二者还存在其他差异：smL1 ORF1带有两个非同义替换（G53D和H159D），其起始密码子处带有工程化Kozak共有序列，且smL1的3′UTR缺失了末端159 bp的富含鸟苷酸区（guanosine-rich region, GRR），即保守的poly-purine区。研究人员据此系统评估了这些非编码差异及合成ORF序列对小鼠L1逆转座效率的影响，以解析smL1高效逆转座的真正机制。

研究人员构建了一系列L1spa和smL1突变体，在HeLa-JVM细胞中进行瞬时转染逆转座实验，并结合3′RACE、qRT-PCR、Western blot及反向PCR等方法进行机制探究。主要关键技术包括：①基于HeLa-JVM细胞系的逆转座报告实验（以新霉素抗性灶计数定量逆转座效率，并用pCEP4-GFP共转染校正转染效率）；②对工程化L1报告构建体进行毛细管测序和ONT长读长测序以确认序列组成；③3′RACE（3′cDNA末端快速扩增）检测L1转录本多腺苷酸化位点；④qRT-PCR定量L1各区域RNA水平；⑤Western blot以抗小鼠L1 ORF1p单克隆抗体检测ORF1p蛋白丰度；⑥反向PCR及Sanger测序表征L1插入结构。

结果：

**质粒测序揭示smL1与L1spa的序列差异。** 通过毛细管测序和ONT长读长测序，研究人员确认smL1 ORF序列相对L1spa主要为同义替换，但ORF1存在G53D和H159D两个非同义替换，且smL1带有一个工程化Kozak共有序列；smL1 3′UTR缺失了含GRR的末端159 bp序列。该缺失可追溯到亚克隆过程中NdeI限制性片段的意外丢失。

**ORF1p H159D部分解释了smL1的高逆转座效率。** 在HeLa细胞逆转座实验中，L1spa的逆转座效率约为smL1的6%；L1spa_H159D和L1spa_Dbl（G53D+H159D）的逆转座效率约为smL1的19%。反向实验中，smL1_D159H和smL1_Dbl（D53G+D159H）的逆转座效率相对smL1降低约40%。这表明H159D氨基酸替换是smL1高效逆转座的部分原因，而G53D影响不大。

**smL1 3′UTR缺失而非合成ORF序列是高效逆转座的主要原因。** L1spa_Dbl_smBB（无合成ORF序列，含L1spa_Dbl ORF1p氨基酸序列、Kozak共识和smL1突变型3′UTR）的逆转座效率与smL1相当；在其3′UTR中恢复GRR序列（L1spa_Dbl_smBB_restore_3′UTR）则使逆转座效率降至L1spa_Dbl_smBB的约16%。因此，smL1相对L1spa的逆转座效率提升主要源于3′UTR中GRR的缺失，而非合成ORF序列。

**GRR是抑制天然小鼠L1逆转座的关键序列。** 将L1spa GRR单独插入L1spa_Dbl_smBB的NEO cassette上游即足以将逆转座效率降至约12%；L1spa 3′UTR的非GRR部分无此效应。来自L1_TF、L1_GF、L1_A、L1_V和L1_F各亚家族的GRR序列均具有类似抑制效应（<20%）。GRR内连续鸟苷酸串的逐步恢复导致逆转座效率渐进下降，抑制程度与GRR长度正相关。

**GRR的逆转座抑制效应具有位置依赖性。** 将GRR置于NEO cassette下游（L1spa_Dbl_smBB_GRRAN）时，逆转座效率约为L1spa_Dbl的7倍，与完全缺失GRR的L1spa_Dbl_smBB相近。但GRR缺失或移位无法抵消H159对ORF1p核酸伴侣活性的损害（L1spa_SMBB及L1spa_SMBB_GRRAN仅达约20%效率），说明H159效应与GRR位置效应相互独立。

**GRR不影响L1转录本多腺苷酸化或插入结构。** 3′RACE实验在GRR上游或内部未检测到提前多腺苷酸化产物；对L1spa_Dbl_smBB_GRRAN产生的10个插入进行结构解析，均显示3′poly-A尾位于GRR下游SV40多腺苷酸化信号处，并具备典型L1插入特征（靶位点重复、TTTTT/AA共识切割位点等），证明GRR抑制效应并非通过异常多腺苷酸化或改变插入结构实现。

**GRR对L1 RNA水平的影响不能解释逆转座效率差异。** qRT-PCR显示smL1各区域RNA水平显著高于所有天然L1构建体；天然L1构建体中GRR的存在普遍降低RNA水平，但这种降低与逆转座效率变化不一致（如L1spa_Dbl_smBB_GRRAN RNA水平低于L1spa_Dbl_smBB但逆转座效率相当），说明RNA丰度并非逆转座效率的决定因素。

**GRR通过调节ORF1p蛋白水平影响逆转座效率。** Western blot结果表明，GRR位于NEO cassette上游时（L1spa_Dbl、L1spa_Dbl_smBB_restore_3′UTR）ORF1p水平较L1spa_Dbl_smBB降低约2倍；GRR位于NEO cassette下游时（L1spa_Dbl_smBB_GRRAN）ORF1p水平升高约1.5倍。smL1 ORF1p水平比L1spa_Dbl_smBB高约15倍，加入GRR（smL1_spa3′UTR）后仅轻度降低，但逆转座效率不受影响，说明smL1因合成ORF序列驱动的高水平蛋白表达而对GRR抑制不敏感。

讨论与结论部分总结如下：本研究表明，smL1相对L1spa逆转座效率的提升并非源于ORF腺苷酸含量的合成性降低，而是ORF1p H159D替换与3′UTR GRR缺失共同作用的结果。这解开了合成人类L1（ORFeus_Hs）仅获3倍效率提升而合成小鼠L1获200倍提升的长期矛盾——合成ORF虽显著提高RNA水平，但RNA升高并不等比转化为逆转座效率。研究人员提出，ORF1p水平对逆转座效率存在阈值效应：对天然小鼠L1而言，GRR位于上游使ORF1p水平降低至阈值以下从而抑制逆转座，而删除或移位GRR使ORF1p水平超过阈值即可恢复高效逆转座；smL1因ORF1p水平极高，GRR导致的轻微降低不足以影响逆转座。该模型同时解释了H159变体的表型效应——受损的ORF1p无法被高表达弥补。GRR位置依赖效应可能仅存在于工程化报告构建体中，内源性L1中GRR位于转录单元3′端近端，其适度提升ORF1p表达的作用可能对体内L1活性更重要。本工作强调了工程化L1报告构建体中非编码序列完整性与指示cassette位置的重要性，并展示了构建保留完整L1序列且具有接近smL1逆转座效率的天然小鼠L1构建体（如L1spa_Dbl_smBB_GRRAN）的可行性，为后续体内外研究提供了更贴近内源性L1行为的工具。