《PLOS Pathogens》：Bacterial immune priming and Wolbachia-mediated dengue blocking in Aedes albopictus mosquitoes
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背景：Wolbachia 是一种母系传播的细菌内共生体（bacterial endosymbiont），在节肢动物中高度流行。许多 Wolbachia 菌株诱导病原阻断（pathogen blocking），从而保护宿主免受病原微生物感染。针对致病细菌的阻断发
背景：Wolbachia 是一种母系传播的细菌内共生体（bacterial endosymbiont），在节肢动物中高度流行。许多 Wolbachia 菌株诱导病原阻断（pathogen blocking），从而保护宿主免受病原微生物感染。针对致病细菌的阻断发生于埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，其中 Wolbachia 已通过显微注射（microinjection）人工建立。然而，在 Drosophila 果蝇中，该阻断发生于口服细菌攻击后，而非经注射的系统性攻击后。病原阻断已与 Wolbachia 感染相关的宿主免疫活性升高相联系。这与昆虫中的免疫 priming（immune priming）在原理上相似，免疫 priming 是一种记忆免疫反应，其中亚致死暴露于病原体可提高宿主存活未来感染的能力。白纹伊蚊（Aedes albopictus）天然携带 Wolbachia；然而，天然 Wolbachia 介导的病原阻断和免疫 priming 在多大程度上影响宿主对感染的反应仍不清楚。因此，研究人员试图表征感染 Wolbachia 的 Ae. albopictus 对细菌攻击的反应，并确定这些微生物组合是否可阻碍随后的登革病毒（dengue virus, DENV）感染。
方法/主要发现：研究人员用亚致死剂量的四种蚊相关细菌攻击携带和不携带天然 Wolbachia 感染的成年雌性 Ae. albopictus：Micrococcus、Staphylococcus（革兰阳性，gram positive）、Brevundimonas、Enterobacter（革兰阴性，gram negative）。评估攻击后死亡率后，研究人员观察到 Wolbachia 感染降低了累计死亡率，并延迟了接受每种细菌攻击的蚊的衰老开始。然而，这种保护效应对革兰阳性细菌更强。随后，经细菌 priming 的 Ae. albopictus 经口攻击 DENV。研究人员观察到，经历革兰阴性细菌预攻击的蚊与降低的 DENV 流行率和病毒载量相关，而感染 Wolbachia 的蚊表现出病毒载量的进一步降低。
结论/意义：研究人员强调了 Ae. albopictus 中天然 Wolbachia 感染的新特征，包括针对细菌诱导死亡的保护，以及病原阻断与细菌 priming 之间的相互作用可能取决于细菌革兰状态。这些发现为与天然 Wolbachia 相关的免疫相互作用提供了见解，并加深了对蚊适应性免疫的理解。
研究背景与问题：Wolbachia pipientis 是一种革兰阴性细菌内共生体，是节肢动物中最普遍的微生物之一，可通过操纵宿主生殖生物学促进母系传播和种群扩散。许多 Wolbachia 菌株诱导病原阻断（pathogen blocking，指 Wolbachia 介导宿主抵抗病原感染），包括降低或延迟死亡、降低感染流行率、降低病原载量和降低传播率。该现象首次在 Drosophila melanogaster 中发现，也在天然感染 Wolbachia 的 Aedes albopictus（Ae. albopictus，白纹伊蚊）和 Culex quinquefasciatus 中描述。Ae. aegypti 中通过胚胎显微注射建立 Wolbachia 转感染，对登革、寨卡等虫媒病毒及禽疟、丝虫具有阻断作用，是种群替换干预的关键。Wolbachia 对致病细菌和真菌的保护取决于 Wolbachia 菌株、病原递送途径、感染为天然或人工等因素。wMelPop 在 Ae. aegypti 中对多种细菌胸腔注射后有阻断；wMel 则表现细菌特异性差异；Drosophila 中系统注射通常无保护，但口服 Pseudomonas aeruginosa 后及系统真菌攻击有保护。机制尚不确定，可能涉及 Toll 通路免疫效应基因、RNA 干扰、氧化应激、代谢和病毒 RNA 降解等。Wolbachia 介导 Toll 免疫激活更见于转感染而非天然感染；天然感染免疫激活减弱，且在 Drosophila 中无证据参与病原阻断。该理论类似免疫 priming（immune priming，昆虫记忆免疫反应，亚致死暴露增强后续感染清除）。免疫 priming 可跨龄期或跨代，机制涉及先天和细胞免疫。在 Armadillidium vulgare 中，Wolbachia 感染提高 Salmonella enterica 攻击后存活，且同菌预攻击呈年龄依赖增强，提示免疫 priming 与病原阻断可能加性互作。Ae. albopictus 天然携带 wAlbA 和 wAlbB，其虫媒病毒阻断弱、条件性或缺失；天然感染是否保护致病细菌，以及携带 Wolbachia 的蚊中初始微生物攻击是否增强第二次攻击病原阻断，尚不清楚。因此，研究人员开展本研究：表征 Wolbachia 感染 Ae. albopictus 对细菌攻击的反应，并确定这些微生物组合是否阻碍后续 DENV（dengue virus，登革病毒）感染。研究结论显示，天然 Wolbachia 持续保护宿主免于四种细菌诱导死亡；细菌预攻击降低 DENV 感染负担；保护与阻断互作依赖细菌革兰状态，革兰阳性与更强死亡保护相关，革兰阴性与更有效 Wolbachia 介导 DENV 阻断相关。其意义在于强调天然 Wolbachia 抗菌保护、细菌 priming 与 Wolbachia 对 DENV 互作，增进对蚊适应性免疫的理解。
关键技术与方法：使用 2021 年 Florida Vero Beach 采集的 Ae. albopictus 实验种群。WT 天然感染 Wolbachia 并确认含 wAlbA 和 wAlbB；Tet 经四环素连续三代清除 Wolbachia；以 WT 幼虫饲养水接种 Tet 幼虫两代标准化微生物群。四种细菌分离自 2021 年 Vero Beach Oslo Riverfront Conservation Area 蚊标本：Enterobacter sp.、Brevundimonas sp.（革兰阴性），Micrococcus luteus、Staphylococcus hominis（革兰阳性）。成年雌蚊经胸内注射亚致死剂量细菌，监测死亡率并以 Cox 比例风险模型（Cox Proportional Hazards Model, CPH）分析；另先细菌预攻击，6 天后经口感染 DENV-1 BOLKW010（2010 Key West 患者分离，Vero E6 细胞培养），14 dpi（days post infection，感染后天数）取 body、legs、saliva，空斑试验检测，广义线性回归（generalized linear regression, GLM）分析。
主要研究结果：
Wolbachia 对细菌介导死亡率的影响。通过胸腔注射四种细菌，CPH 显示无 Wolbachia 显著增加死亡风险（β=1.391，Z=2.31，P=0.0210）。细菌攻击后 Tet 中位生存时间比 WT 短 6–8 天。WT 与 Tet 成对比较显示，Micrococcus、Staphylococcus、Brevundimonas、Enterobacter 攻击后无 Wolbachia 均显著增加死亡。每种细菌处理均显著增加死亡风险，Brevundimonas 风险最高（β=18.312）。Wolbachia×Micrococcus 交互显著（β=1.579，Z=2.47，P=0.0137），Staphylococcus 呈边缘效应（P=0.0528），革兰阴性交互较小且不显著。因此，Wolbachia 保护对革兰阳性更强。混杂因素包括 Tet 基线适合度较低和 mock 注射增加死亡，但非注射与 mock 中 Wolbachia 状态无显著差异。
Wolbachia 和细菌 priming 对登革感染的影响。WT/Tet 先接受亚致死细菌，6 天后经口感染 DENV-1。14 dpi body 中 DENV 流行率方面，Wolbachia 无显著影响；革兰阴性预攻击使流行率相对降低 23.61%（Z=-2.671，P=0.0076），革兰阳性无变化；无 priming×Wolbachia 交互。腿和唾液无显著影响。body 中 DENV 载量方面，革兰阳性（t=-2.313，P=0.0218）或革兰阴性（Z=-5.569，P=8.77e-8）预攻击均降低载量；Wolbachia 单独无影响；革兰阴性×Wolbachia 交互显著降低载量（t=2.108，P=0.0363），革兰阳性无交互。腿和唾液无影响。
讨论部分总结：
Wolbachia 介导的 Aedes albopictus 细菌保护。研究识别出二分和三分微生物互作。天然 Wolbachia 显著增强 Ae. albopictus 对四种细菌系统感染的存活，确认天然 Wolbachia 中发生抗菌病原阻断。保护对革兰阳性更强，与 Wolbachia 增强 Toll 通路激活一致。该模式不同于其他 Wolbachia-宿主系统：Drosophila 天然 Wolbachia 对胸腔细菌攻击不保护，但口服细菌和系统真菌攻击有保护；转感染 Ae. aegypti 的抗菌效果因菌株而异，wMelPop 强于 wMel，wMel 对 Mycobacterium marinum 无阻断。总体说明抗菌能力在不同昆虫系统差异大。实验设计无法区分是增强细菌清除还是增加耐受，需要更严格检查宿主、菌株、剂量、载量、递送途径和 Wolbachia 菌株。
在无 Wolbachia 介导 DENV 阻断时细菌 priming 限制 DENV 感染。细菌 priming 独立于 Wolbachia 感染状态。革兰阳性预攻击降低 DENV 载量，革兰阴性降低流行率和载量。该差异值得注意，因革兰阴性主要激活 IMD 通路，通常对登革响应不如 Toll 通路重要；通路间 crosstalk 可能参与。结果符合典型昆虫免疫 priming，但未验证免疫反应诱导。亚致死细菌仍造成死亡，存活 6 天者可能是更健壮或免疫活性更高的非随机子集。免疫 priming 已在 Ae. aegypti 登革、Anopheles gambiae 大肠杆菌等系统观察。未发现天然 Wolbachia 介导 DENV 阻断，与既往弱或缺失一致，也与 Culex pipiens 复合体 wPip 对西尼罗病毒强抗病毒形成对比。结果确认天然 Wolbachia 病原阻断的变异性。
两种革兰阴性细菌 priming 引发略强的 Wolbachia 介导 DENV 阻断。革兰阴性预攻击显著降低 Wolbachia 感染蚊 body 中 DENV 滴度，提示细菌 priming 与天然 Wolbachia 病原阻断可互作，可能由革兰阴性驱动；但仅测试每类两种细菌，需更多细菌验证。这也表明天然 Wolbachia 具有潜伏、可诱导抗病毒潜力，但幅度小且限于 body。类似 A. vulgare 中 priming 和非致死 Salmonella 增强后续高剂量存活。机制尚不清楚；免疫 priming 涉及抗菌肽、细胞免疫、Lipoxin/Lipocalin 复合体和前列腺素 E2；Wolbachia 阻断涉及先天免疫效应子上调、活性氧和黑化。Ae. albopictus 天然感染分子后果未表征；Ae. fluviatilis 转录组提示小免疫影响、氧化应激、血脂和糖原及中肠活性氧变化。免疫活性、病原阻断和免疫 priming 均有代谢和生理成本。
研究局限。结果来自单一 Ae. albopictus 种群；使用少量细菌、单一 DENV 和单一剂量；未定量 Wolbachia 和细菌；未在转感染蚊中检验；Tet 基线适合度较低；DENV 攻击时细菌可能未清除，结果可能反映共感染；注射存在死亡效应，但跨 50 天监测且 WT/Tet 无差异；未提出互作机制。
研究结论翻译：通过用四种致病细菌分离株攻击感染和未感染 Wolbachia 的蚊，研究人员证明 Ae. albopictus 天然 Wolbachia 持续保护宿主免于细菌诱导死亡。研究人员还证明，这些细菌预攻击降低宿主 DENV 感染负担。有趣的是，根据革兰状态观察到 Wolbachia 与致病细菌之间相反的互作。革兰阳性细菌攻击与更强的 Wolbachia 介导死亡保护相关。同时，革兰阴性细菌预攻击与更有效的 Wolbachia 介导 DENV 阻断相关。这些互作凸显天然 Wolbachia 感染相关微生物互作的复杂性及其对重要蚊媒免疫反应的贡献。
