RLR-MAVS-IRF3轴感知Tonate病毒（TONV）并激活IFN-I依赖性抗病毒状态

《PLOS Pathogens》：The RLR-MAVS-IRF3 axis activates the IFN pathway to restrict Tonate virus (TONV) infection

　　

Tonate病毒（TONV）是一种被忽视的蚊媒甲病毒（alphavirus），属于委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis, VEE）复合群，与发热性疾病、脑炎以及胎儿中枢神经系统异常相关。然而，感知TONV感染并限制其复制的宿主通路仍缺乏明确界定。在此，研究人员在人类T98G和A549细胞中研究了TONV与I型干扰素（type I interferon, IFN-I）系统之间的相互作用。研究人员表明，TONV感染导致胞质双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）积累以及强烈的IFN应答。RIG-I（retinoic acid-inducible gene I）和MDA5（melanoma differentiation-associated protein 5）的缺失，以及MAVS（mitochondrial antiviral-signaling protein）和IRF3（interferon regulatory factor 3）的缺失，强烈降低了TONV诱导的IFN应答。破坏RIG-I、MDA5、MAVS或IRF3导致dsRNA阳性细胞增加和更高的病毒RNA积累。最后，研究人员发现，外源性IFN-I处理强烈抑制TONV复制，降低病毒RNA载量和感染性颗粒产生。因此，综合而言，这些结果确定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF3轴是感知TONV感染并建立IFN-I依赖性抗病毒状态的主要通路，首次提供了TONV在人细胞中天然免疫感知的分子特征。

研究背景与问题
Tonate病毒（TONV）是一种被忽视的蚊媒甲病毒（alphavirus），历史上属于委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis, VEE）病毒IIIB亚型复合群，属于具有神经趋向和潜在新发性的新世界脑炎性甲病毒。TONV自20世纪70年代在法属圭亚那首次鉴定，在拉丁美洲北部特定区域持续循环，并有人群暴露和较高血清阳性率报道。多数感染表现为非特异性虫媒病毒发热病，常与登革热等重叠，导致诊断不足；罕见但有致死性脑炎和垂直传播伴严重胎儿中枢神经系统病变报道。其生态学仍部分不明，已从蚊、鸟、巢蝽和蝙蝠中分离。近期实验显示白纹伊蚊（Aedes albopictus）对TONV传播有胜任力。甲病毒感染结局受I型干扰素（type I interferon, IFN-I）应答强烈影响，病毒对IFN-I敏感性与VEEV减毒和毒力相关，且甲病毒已进化出多种天然免疫拮抗机制。RIG-I样受体（RIG-I-like receptors, RLRs）可驱动MAVS和IRF3依赖性抗病毒程序，但TONV是否遵循该甲病毒范式未知。因此，研究人员开展TONV与人IFN-I系统及上游天然免疫感知通路的相互作用研究。

研究人员开展研究与结论意义
研究人员在人类T98G胶质母细胞瘤来源成纤维样细胞和A549肺上皮癌细胞中研究TONV与IFN-I系统相互作用。结果显示，TONV感染诱导强IFN应答，外源IFN-I强烈抑制TONV复制；RIG-I/MDA5-MAVS-IRF3轴是感知TONV并建立IFN-I依赖性抗病毒状态的主要通路。该工作首次提供TONV在人细胞中天然免疫感知的分子特征，为未来致病机制、免疫控制、抗病毒干预和被忽视新发甲病毒防范提供基础。

关键技术方法
研究人员使用Caroline Goujon提供的人T98G和A549细胞。TONV CaAn 410d株来源于CRORA collection, Institut Pasteur, Paris，1973年从法属圭亚那的Psarocolius decumanus分离，经新生小鼠传代后于VERO细胞传9次。感染采用感染复数（multiplicity of infection, MOI）0.001、0.01、0.1或1 pfu/cell，感染后24 h分析。利用CRISPR-Cas9构建T98G^RIG-I-/-、T98G^MDA5-/-、T98G^{RIG-I-/- MDA5-/-}、T98G^MAVS-/-和T98G^IRF3-/-细胞，并以免疫印迹（Western blot, WB）验证。采用反转录定量PCR（RT-qPCR）检测病毒RNA和基因表达，HEK-Blue IFN-α/β报告细胞检测生物活性IFN，TCID₅₀/mL测定感染性颗粒，J2抗体免疫荧光及共聚焦/ImageXpress Pico定量dsRNA。统计用Student t检验。

研究结果
Tonate病毒（TONV）感染增加T98G和A549细胞中的I型IFN应答
通过RT-qPCR检测感染后48 h内IFNβ、ISG15和TONV mRNA，并用HEK-Blue IFN-α/β报告细胞检测IFNβ细胞因子。结果显示，T98G和A549细胞中IFNβ和干扰素刺激基因随感染时间增加，且与TONV MOI相关；感染细胞分泌生物活性I型IFN，呈MOI依赖性。结论：TONV感染可诱导I型IFN应答。

外源性干扰素损害T98G和A549细胞中的TONV复制
在感染前24 h用不同单位IFN-α/β预处理A549和T98G细胞，感染后24 h用RT-qPCR检测病毒RNA（18S rRNA归一化），用TCID₅₀/mL检测上清感染性颗粒。结果：IFN预处理显著降低病毒RNA载量和感染性颗粒产生，且不依赖所用MOI；IFN预处理增加ISG水平。结论：TONV在IFN刺激细胞中受到限制，可能通过IFN刺激基因作用。

RLRs-MAVS-IRF3信号轴对TONV感知至关重要
用CRISPR-Cas9构建RIG-I、MDA5、RIG-I/MDA5双敲、MAVS和IRF3敲除T98G细胞，WB验证蛋白。感染后24 h检测TONV RNA、ISG15，并用HEK-Blue检测IFNα/β。结果：敲除各基因导致TONV RNA载量升高，IRF3敲除最明显。低MOI时，KO细胞病毒RNA较WT非显著增加，但IFNβ释放显著降低；高MOI时，MAVS和IRF3 KO中IFNβ产生严重受损，IRF3 KO最明显。单RIG-I或MDA5 KO降低IFNβ，双RIG-I/MDA5 KO呈叠加效应，IFNβ水平接近MAVS KO。KO细胞中ISG15和MX1 mRNA也降低。结论：MAVS-IRF3轴控制TONV诱导IFN应答，RIG-I和MDA5共同参与感知。

RLRs-MAVS-IRF3通路受损导致胞质dsRNA积累
用J2抗dsRNA抗体免疫荧光检测TONV感染24 h后胞质dsRNA，共聚焦显微镜定性，ImageXpress Pico定量WT和KO T98G中dsRNA阳性细胞。结果：TONV感染诱导胞质dsRNA形成；与WT相比，RIG-I、MDA5、MAVS和IRF3 KO均增加dsRNA阳性细胞，IRF3 KO最高，其次MAVS KO，再次RLR KO。这与RT-qPCR病毒RNA载量一致。结论：RLR-MAVS-IRF3通路受损导致胞质dsRNA积累，提示病毒复制增加，TONV由RLR-MAVS-IRF3通路感知并激活IFN以限制复制。

讨论部分总结与结论翻译
讨论指出，TONV尽管长期循环、有人群暴露和罕见严重神经/胎儿疾病报道，仍是最少表征的蚊媒甲病毒之一。本研究证明外源IFN-I强烈限制TONV，感染本身诱导IFN应答；RIG-I/MDA5-MAVS-IRF3轴是主要控制通路。TONV对IFN高敏感与甲病毒总体一致，VEE复合群中IFN敏感性与减毒、毒力相关。TONV诱导IFNβ、ISG15和功能性I型IFN细胞因子，J2检测dsRNA支持胞质复制相关RNA作为病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）被感知。RIG-I和MDA5均贡献IFNβ诱导，双RLR、MAVS或IRF3缺失影响更强并伴病毒积累增加，符合两种RLR部分冗余或互补、MAVS/IRF3位于下游并汇聚于IFN诱导核心通路的模型。使用人脑来源T98G细胞增加临床相关性。局限包括：使用永生化人细胞系，不能完全代表体内靶细胞；未定义感染中被识别的具体vRNA种类及RIG-I与MDA5随时间相对贡献；MAVS KO与IRF3 KO差异尚不清楚；不能排除MAVS非依赖、IRF3依赖的感知通路如TLR3/TRIF参与，其他甲病毒如基孔肯雅病毒已有报道。未来需确定TONV是否像其他甲病毒编码IFN诱导或信号拮抗剂。TONV处于忽视、诊断不确定和潜在新发关注交叉点，白纹伊蚊可传播TONV增加理解其传播范围扩展前的重要性。结论翻译：因此，总之，这些结果确定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF3轴是感知TONV感染并建立IFN-I依赖性抗病毒状态的主要通路，首次提供了TONV在人细胞中天然免疫感知的分子特征。