外周血FOXP3+调节性T细胞作为局部晚期宫颈癌同步放化疗反应潜在预测标志物

《Immunobiology》：Peripheral FOXP3+ regulatory T cells as potential predictive markers of concurrent chemoradiation therapy response in locally advanced cervical cancer

　　

同步放化疗（concurrent chemoradiation therapy，CCRT）是局部晚期宫颈癌（locally advanced cervical cancer，LACC）的标准治疗方案；然而，约30%的患者反应不佳，且替代治疗选择仍然有限。研究人员旨在识别与治疗反应相关的外周免疫生物标志物，并表征临床结局背后的免疫机制。研究人员招募了30例接受CCRT的LACC患者，并在治疗结束后3个月根据实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）将其分为应答组（n=15）和非应答组（n=15）。在基线和治疗后1个月及3个月时收集外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。采用流式细胞术分析CD4⁺和CD8⁺ T细胞、CD4⁺叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）⁺调节性T细胞、产生干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的T细胞以及表达程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）的耗竭T细胞。应答组显示基线CD4⁺ T细胞、FOXP3⁺调节性T细胞和产生IL-10的CD4⁺ T细胞水平升高，同时治疗期间产生IFN-γ的CD8⁺ T细胞增加。非应答组表现出PD-1表达CD8⁺ T细胞升高，调节性和效应性T细胞活性降低。纳入FOXP3⁺调节性T细胞和PD-1表达的比值显示出强大的预测性能，曲线下面积（area under the curve，AUC）高达0.98。这些研究结果表明，调节性-效应性T细胞谱的平衡与CCRT的良好反应相关，而T细胞耗竭增加与治疗失败相关。外周免疫分析可能为LACC治疗结局的早期预测提供一种微创方法。

宫颈癌仍然是全球重大的健康负担，在泰国，大多数病例确诊时已处于局部晚期阶段（LACC）。同步放化疗（CCRT）是LACC的标准治疗方案，然而其有效率约为70%，对反应不佳的患者可选择的治疗手段十分有限。目前用于监测治疗反应的影像学和肿瘤标志物方法无法反映治疗过程中全身免疫系统的动态变化，而外周免疫分析提供了一种微创手段来捕获这些变化。调节性T细胞（Tregs）以表达转录因子FOXP3为特征，在维持免疫耐受和调控抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，FOXP3⁺ Tregs已在多种癌症中被证实与临床结局相关，但大多数证据源于肿瘤组织，其作为易获取的外周血生物标志物的价值尚不明确。此外，T细胞的功能可塑性和耗竭标志物（如PD-1）在抗肿瘤免疫和治疗反应中具有重要作用。因此，该研究旨在通过纵向免疫分析，探究LACC患者CCRT治疗前后外周血T细胞亚群特征与治疗反应的关系，寻找能够早期预测CCRT疗效的外周免疫生物标志物。

研究人员开展了一项前瞻性临床研究，纳入30例在Songklanagarind医院门诊接受CCRT治疗的LACC患者。在治疗前（基线）、治疗后1个月和3个月三个时间点采集外周血，分离外周血单个核细胞（PBMCs）后冻存。通过多色流式细胞术对CD4⁺、CD8⁺ T细胞，CD4⁺FOXP3⁺ Tregs，产生IFN-γ和IL-10的T细胞亚群以及表达PD-1的T细胞亚群进行检测。治疗结束后3个月依据实体瘤疗效评价标准（RECIST）将患者分为应答组（n=15）和非应答组（n=15）。统计分析采用Fisher精确检验比较临床特征，双向重复测量方差分析比较两组间免疫标志物随时间的动态变化，受试者工作特征（ROC）曲线用于评估各免疫参数预测治疗反应的效能，以约登指数和最高阳性似然比确定最佳截断值。

### 3.1 患者临床特征
应答组和非应答组各15例。两组患者在年龄（中位年龄均为43岁）、FIGO分期（≥IIIB期患者比例分别为66.7% vs. 80.0%）、组织学类型（鳞状细胞癌为主，分别占86.7% vs. 73.3%）、基线白细胞计数和淋巴细胞计数方面均无显著差异。治疗评估显示应答组全部达到完全缓解，而非应答组包含部分缓解、疾病稳定和疾病持续的患者。

### 3.2 CCRT期间外周T细胞亚群的动态变化在应答者与非应答者间存在差异
在基线时，应答组CD4⁺ T细胞比例显著高于非应答组，而两组CD8⁺ T细胞频率相当。CCRT治疗后，两组CD4⁺ T细胞均下降，CD8⁺ T细胞频率增加，非应答组在治疗后1个月增加最显著。应答组基线CD4/CD8比值显著升高，治疗后两组均下降。应答组基线及治疗完成后IL-10⁺ CD4⁺ T细胞和CD4⁺FOXP3⁺ Tregs频率均高于非应答组，而非应答组在整个治疗过程中这两类细胞水平持续偏低。

### 3.3 CCRT期间调节性T细胞谱在应答者与非应答者间存在差异
基线CD4⁺CD25⁺CD127^low Tregs频率在两组间无显著差异，非应答组在治疗后1个月出现该群Tregs的短暂增加。应答组在基线和治疗完成后CD4⁺FOXP3⁺ Tregs频率显著高于非应答组，尽管两组均在治疗后1个月出现一过性升高，但非应答组随后下降。

### 3.4 产生效应细胞因子的T细胞在CCRT期间变化有限
基线时应答组CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞比例显著高于非应答组，并在治疗后3个月仍维持较高水平。应答组CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞在基线和治疗完成后也高于非应答组，但组间差异不如CD8⁺ T细胞亚群明显。非应答组在各时间点均持续表现低频率的IFN-γ产生T细胞应答。

### 3.5 CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群PD-1表达在应答者与非应答者间存在差异
两组CD4⁺PD-1⁺ T细胞基线水平无显著差异，治疗后1个月均升高。应答组基线CD4⁺IFN-γ⁺/CD4⁺PD-1⁺比值和CD4⁺FOXP3⁺/CD4⁺PD-1⁺比值显著高于非应答组，且该差异持续到治疗结束后。CD8⁺PD-1⁺ T细胞基线无组间差异，治疗后均升高，但应答组CD8⁺IFN-γ⁺/CD8⁺PD-1⁺比值在基线和治疗后均显著更高，FOXP3⁺ Treg/CD8⁺PD-1⁺比值也呈现相同趋势。

### 3.6 外周T细胞参数对治疗反应的预测效能
ROC曲线分析显示，CD4/CD8比值（AUC=0.81）、CD4⁺FOXP3⁺ T细胞（AUC=0.86）、CD4⁺IL-10⁺ T细胞（AUC=0.88）、CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞（AUC=0.80）、总CD4⁺FOXP3⁺ Tregs频率（AUC=0.90）和CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞（AUC=0.81）均具有一定预测能力。功能与耗竭相关比值进一步提高了区分度：CD4⁺IFN-γ⁺/CD4⁺PD-1⁺比值AUC=0.87，CD8⁺IFN-γ⁺/CD8⁺PD-1⁺比值AUC=0.80。值得注意的是，FOXP3⁺ Treg/CD4⁺PD-1⁺比值（AUC=0.91）和FOXP3⁺ Treg/CD8⁺PD-1⁺比值（AUC=0.98）表现出极佳的预测效能，其中后者敏感度达100%，特异度达91.7%。

讨论部分指出，应答者基线FOXP3⁺ Tregs升高可能反映了面对慢性HPV相关炎症时更好的免疫稳态适应，放疗引起的组织损伤和炎症放大可被及时扩增的FOXP3⁺ Tregs缓冲，同时不抑制效应T细胞功能。FOXP3⁺ Treg/PD-1⁺比值，特别是CD8⁺ T细胞中的这一比值，在预测CCRT反应方面表现最强，凸显了免疫调节与耗竭之间的平衡作为治疗结局决定因素的重要性。研究人员还讨论了TGF-β/STING信号通路失调在非应答者中可能导致过度免疫抑制的假说。研究局限性包括单中心小样本、缺乏功能性免疫学实验、未进行肿瘤浸润淋巴细胞配对分析和肿瘤微环境评估，未来需在更大队列中验证，并结合组织分析和机制研究。结论为，外周免疫谱特别是调节性和耗竭性T细胞区室之间的平衡，与LACC患者CCRT治疗反应密切相关，FOXP3⁺ Tregs及其与PD-1⁺比值的预测性能最强，可作为临床早期识别治疗反应不佳患者的微创生物标志物，为个体化免疫调节治疗策略提供依据。