基于贝叶斯双组分混合模型的生乳中凝固酶阳性葡萄球菌（CPS）低/高污染状态概率预测与不确定性传播

《International Journal of Food Microbiology》：A Bayesian two-component mixture model for predicting low and high coagulase-positive staphylococci contamination levels in raw milk

　　

研究人员开发了一个贝叶斯双组分混合模型（Bayesian two-component mixture model），用于预测生乳中凝固酶阳性葡萄球菌（coagulase-positive staphylococci, CPS）污染。CPS污染被表征为潜在的低污染状态和高污染状态。总需氧菌落计数（total aerobic colony count, TBC）与低CPS组分呈正相关。pH改善了预测性能，但仅表现出弱的组分特异性效应。在样本量较小的混合模型中，更宽的先验降低了计算稳定性。

生乳中凝固酶阳性葡萄球菌（coagulase-positive staphylococci, CPS）是奶牛临床乳腺炎常见病原之一。乳腺炎可增加体细胞计数（somatic cell count, SCC）、弃奶、降低产奶量并增加抗菌治疗，给奶农造成经济损失。全球范围内，亚临床乳腺炎较临床乳腺炎更常见；亚临床感染时乳汁未排出，CPS可通过感染乳房直接排乳，也可在农场环境、生乳处理和加工过程中发生交叉污染。CPS一旦进入生乳即可持续存在并增殖。高CPS污染水平与乳制品中葡萄球菌肠毒素产生风险增加相关，肠毒素耐热并可存活于热处理，低至1 μg即可引起食物中毒。产肠毒素S. aureus常携带多个肠毒素和抗菌耐药基因，在动物源食品中频繁分离，因此生乳中CPS受到全球公共卫生关注。pH、环境温度、相对湿度、乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）等内源、外源和隐式因素可影响CPS在生乳中的存活和生长。现有研究多评估单个风险因素，或依赖经典回归模型给出点估计，未充分传播参数不确定性。为此，研究人员开发并测试贝叶斯双组分高斯混合模型，将CPS污染表示为低和高两个潜在状态，并利用常规微生物和理化预测变量进行概率预测。

样本队列来源为意大利托斯卡纳同一乳品厂，2024年10月至2026年1月，对12个生乳批次进行纵向采样，其中6批来自SM农场、6批来自CV农场，每采样时间分析3个生乳样本，共36个样本；数据清理后工作数据集为32个观测。关键技术方法包括：检测CPS、总需氧菌落计数（total aerobic colony count, TBC）、LAB、SCC、蛋白、脂肪和pH，并记录环境温度、相对湿度和降雨；采用Spearman秩相关筛选共线性并标准化连续预测变量；在贝叶斯模型中用brms的mi()功能对缺失TBC和LAB进行模型内插补；拟合两成分高斯混合模型，混合概率按农场建模；使用马尔可夫链蒙特卡洛（Markov chain Monte Carlo, MCMC）采样，通过Pareto平滑重要性采样留一交叉验证（PSIS-LOO）比较模型，并进行后验预测检查、残差诊断、先验敏感性分析和网络预测工具开发。未涉及具体试剂或质粒构建步骤。

研究结果如下。3.1 相关性筛选和预测变量集定义：通过Spearman秩相关筛选，TBC、LAB、蛋白和pH被保留为最少共线且具有生物学可解释性的直接CPS预测变量；LAB与环境温度、相对湿度和SCC强相关，TBC与SCC相关，蛋白与脂肪相关；SCC、脂肪、环境温度和相对湿度仅纳入TBC和LAB的辅助插补子模型，以避免CPS混合方程中的额外共线性。3.2 模型后验摘要和预测比较：两个贝叶斯双组分混合模型均成功拟合，未检测到发散转移，CPS相关Rhat为1.00，bulk和tail有效样本量均>1000。pH扩展模型较无pH模型具有更好的样本外预测性能，elpd_loo分别为?3.57和?6.30，ΔELPD=2.73（SE=1.65），因此保留pH扩展模型为最终模型。最终两成分混合模型较单高斯模型预测性能更好，elpd_loo为?3.51对?11.60，LOOIC为7.03对23.20，ELPD差为8.10（SE=3.40）。TBC与低CPS组分呈正相关（估计值0.49，95%可信区间0.11至0.83），而在高CPS组分中接近零；pH在高CPS组分中呈弱负向趋势。3.3 后验预测充分性和残差：全局后验预测密度叠加显示模型可再现观测Log₁₀ CPS分布的非单峰结构；93.3%的复制数据集至少显示两个模态；农场分层检查显示CV复制密度集中于较高CPS值，SM分布更宽且低CPS概率质量更大；后验预测Pearson型残差未显示明显漏斗形、单调趋势或农场特异性结构，多数残差位于±2内。3.4 后验概率：在平均标准化协变量值下，CV的高CPS后验中位概率为0.872，SM为0.565；CV高CPS概率高于SM的后验概率为0.939；两者中位差为0.283，95%可信区间为?0.083至0.785。基于后验中位归属概率，26个观测更可能属于高CPS组分，6个属于低CPS组分；CV的18个观测均更可能属于高CPS组分，SM中8个更可能属于高CPS组分、6个属于低CPS组分；中间CPS值样本的不确定性最大。3.5 敏感性分析：窄先验模型获得满意MCMC诊断，低和高CPS组分截距分离保留，TBC与低CPS组分正相关稳定（估计值0.45，95%可信区间0.10至0.75），高CPS组分pH弱负趋势保留。宽先验模型计算稳定性下降，1.5倍宽先验最大Rhat约1.39至1.41且有效样本量低，1.25倍宽先验仍显示部分参数后验探索不完整；因此，小样本有限混合模型需要弱至中等信息先验以提高后验稳定性。3.6 网络预测工具：开发了两种预测模式，即农场条件预测模型和农场不可知预测模型；输入变量包括TBC、LAB、蛋白含量和pH；输出包括Log₁₀ CFU mL^?1尺度CPS后验预测分布、后验预测中位数与95%区间、低/高污染潜在状态概率，以及超过用户定义阈值10⁵ CFU mL^?1的后验概率；作者未使用外部数据量化其预测性能。

讨论部分认为，生乳CPS污染是全球食品安全问题。本研究的新颖性在于整合常规微生物、理化和气候变量，应用贝叶斯双组分高斯混合模型对生乳CPS浓度进行概率预测，并显式考虑不确定性；模型将CPS浓度表示为低和高污染潜在状态，传播有限样本量、缺失微生物预测变量和后验潜在状态分配带来的不确定性。后验预测诊断表明混合模型可充分再现观测的非单峰CPS浓度。两成分混合模型样本外预测性能优于单高斯模型，而三成分高斯混合模型后验计算较差，包括发散转移、最大树深饱和、高Rhat和极低有效样本量，因此未保留，两成分结构被解释为简约且具有生物学动机的低/高污染表示。关键发现是，在考虑CPS浓度非单峰分布后，多数实测协变量效应较小且不确定性较大，提示未测量的农场和加工相关因素，如牛群乳房健康分布、挤奶卫生、设备清洁、冷却时间、贮存条件和人员污染，可能比模型纳入的常规变量独立贡献更大。TBC与低CPS组分关联最清晰，但高CPS组分中TBC效应接近零，且观测数据不支持因果推断。pH改善样本外预测，但组分特异性效应应谨慎解释；高CPS组分中pH呈弱负趋势，低CPS组分中关联高度不确定，生乳pH生理范围窄和样本量有限限制因果解释。LAB和乳蛋白未显示强的组分特异性后验证据；LAB弱且不确定的负关联不否定其对S. aureus的拮抗作用，但该作用依赖菌株、基质和环境条件，常规LAB计数在生乳中的预测价值有限。农场混合概率显示CV高CPS状态后验中位概率高于SM，但农场对比可信区间包含零，说明存在方向性证据但精度不足，不能确定性分类。方法学上，贝叶斯框架适合有限数据集，先验正则化对有限高斯混合模型可靠估计至关重要。该模型是概念验证型决策支持模型，未来需在更大独立数据集、更广地理覆盖、不同农场管理实践和菌株水平信息中进行外部验证。

结论翻译：本研究结果证明，正则化贝叶斯混合建模框架用于生乳中CPS概率预测具有可行性。在当前形式下，该模型应被解释为概念验证，而非操作性决策支持工具。其主要价值在于提供具有不确定性意识的CPS浓度预测，以及属于低污染或高污染状态的后验概率。这些概率输出可支持探索性样本排序，并有助于未来基于风险的监测和监视策略开发。为促进该贝叶斯混合建模框架的实际使用，研究人员开发了一个网络预测工具并将公开提供。该应用被定位为研究原型，不应作为微生物检测的替代品。对于训练数据范围之外的输入值，预测结果会被自动标记为外推，并应谨慎解释。