近红外光触发杂交膜伪装细菌炸弹用于生物正交催化增强肿瘤焦亡

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Near-infrared light-ignited hybrid membrane-camouflaged bacterial bombs for bioorthogonal catalysis-boosted tumor pyroptosis

　　

焦亡（pyroptosis）可促进抗肿瘤免疫，但其疗效常受限于对间接信号级联的依赖、内在细胞保护机制以及肿瘤细胞中gasdermin（GSDM）表达的频繁沉默。研究人员开发了一种通过靶向递送基因工程减毒鼠伤寒沙门氏菌（eVNP，一种设计用于表达GSDMD-NT的菌株）来精准激活肿瘤焦亡的策略。该平台将近红外（NIR）触发的焦亡诱导与Pd⁰催化的自噬抑制相结合，从而实现了时空精准性和放大的肿瘤细胞死亡。eVNP被由钯矿化肿瘤细胞膜和表达水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的HEK293T细胞膜组成的杂交膜所伪装。这种杂交包覆赋予了同源肿瘤靶向、免疫逃逸和pH响应性膜融合能力，从而促进细胞内化。在NIR照射下，热诱导启动子驱动GSDMD-NT表达，导致细菌自身裂解，随后将GSDMD-NT释放至细胞质中以启动焦亡。与此同时，Pd⁰催化的生物正交反应激活自噬抑制剂，抑制自噬并放大焦亡性细胞死亡。在体内，该系统实现了肿瘤抑制并重编程免疫抑制性肿瘤微环境，为推进癌症免疫治疗提供了一种稳健且整合的策略。

论文解读：近红外光触发杂交膜伪装细菌炸弹用于生物正交催化增强肿瘤焦亡

焦亡（pyroptosis）是一种以gasdermin家族蛋白形成膜孔为特征的程序性细胞死亡方式，其伴随的炎症信号释放可激发强效抗肿瘤免疫。然而，基于焦亡的癌症治疗面临多重障碍：间接激活依赖上游信号通路，机制复杂且受反馈抑制；肿瘤细胞常通过表观遗传沉默gasdermin（GSDM）表达而逃逸焦亡；而外源递送GSDMD N端片段（GSDMD-NT）的mRNA或全长蛋白分别依赖宿主翻译机制或需要额外蛋白加工，直接递送活性GSDMD-NT又受限于跨膜转运难题。为此，研究人员开发了一种基于基因工程减毒沙门氏菌（eVNP）的多功能递送平台，通过杂交膜伪装和近红外（NIR）光触发实现肿瘤细胞内的精准焦亡激活。

研究人员构建了表达GSDMD-NT的温度敏感型工程菌eVNP，并将其包覆于由钯矿化4T1肿瘤细胞膜（PdTM）和表达VSV-G的HEK293T细胞膜（VHM）组成的杂交膜中，获得eVNP@VPdM。该平台通过机械共挤出制备，兼具同源肿瘤靶向、免疫逃逸和pH响应性膜融合能力。在NIR照射下，Pd纳米颗粒的光热效应激活热诱导启动子，驱动GSDMD-NT表达，导致细菌自身裂解并释放效应蛋白；同时，Pd⁰催化生物正交反应激活自噬抑制剂前药（pro-MA），在肿瘤原位释放3-甲基腺嘌呤（3-MA），抑制保护性自噬，从而放大焦亡效应。体内外实验表明，该策略可有效抑制4T1肿瘤生长，并重塑免疫抑制性微环境。

关键的技术方法包括：利用电转化法将重组质粒pBV220-GSDMD-NT导入VNP20009；通过Pd自矿化制备PdTM，并用VSV-G转染HEK293T细胞提取VHM；采用机械挤出法制备杂交膜包覆细菌。研究采用了透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、SDS-PAGE、X射线光电子能谱（XPS）等手段表征材料；以荧光前药alloc-RH110和pro-MA评估生物正交催化效率；通过808 nm激光照射测试光热转换性能；利用共聚焦显微镜观察pH依赖性细胞摄取、线粒体膜电位（JC-1）及活性氧（ROS）水平；采用微流控芯片构建3D肿瘤球评估穿透能力；体内实验在BALB/c小鼠4T1荷瘤模型中进行，结合活体成像、组织病理染色、流式细胞术及酶联免疫吸附测定（ELISA）评价抗肿瘤效果和免疫激活水平。实验涉及4T1、B16F10、HEK293T细胞系及小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）等模型。

研究结果分述如下：

3.1 eVNP@VPdM的表征：TEM和元素mapping证实了Pd纳米颗粒（平均尺寸5.49 nm）成功修饰于细菌表面；SDS-PAGE显示杂交膜保留了各组分特征蛋白；荧光共定位（Pearson相关系数0.84）及流式双阳性比例（77.7%）证明杂交膜均匀包覆；紫外-可见-近红外光谱显示其在400–850 nm具有宽带吸收，zeta电位表明表面电荷变得更负，细菌生长曲线显示膜包覆对增殖影响很小。

3.2 eVNP@VPdM的性能评估：Pd⁰催化alloc-RH110脱笼呈浓度和时间依赖性；高效液相色谱证实pro-MA可在24 h内被逐步转化为3-MA，转化效率达97.7%；808 nm激光照射下，菌液温度可升至42 °C以上，且经五个开关循环仍保持稳定；42 °C培养导致细菌死亡，DAPI/PI染色及TEM显示膜穿孔，SDS-PAGE检测到GSDMD-NT释放；EGFP报告基因证实热诱导表达可随时间逐渐增强。

3.3 酸性pH触发的膜融合促进肿瘤细胞内化：在pH 6.5条件下，VSV-G介导的膜融合导致4T1细胞发生合胞体形成；荧光共定位显示eVNP@VPdM在酸性环境下与细胞膜明显融合；低温（4 °C）下仍残留pH依赖性摄取，表明存在能量非依赖的膜融合途径；与未包覆细菌相比，eVNP@VPdM在巨噬细胞中摄取减少，血液清除减慢，说明杂交膜提高了滞留时间和肿瘤富集可能。

3.4 激光照射激活eVNP@VPdM中热诱导GSDMD-NT表达：利用pBV220-GSDMD-NT-EGFP质粒，激光照射后可在细胞质中观察到EGFP荧光，表明GSDMD-NT成功表达；表达产物初期与线粒体共定位，24 h后信号转移至细胞膜，符合GSDMD-NT从胞内结合到膜打孔的时序特征。

3.5 eVNP@VPdM触发肿瘤细胞焦亡：显微镜下可见激光加pro-MA联合处理组出现典型焦亡形态（肿胀、膜出泡、裂解）；Calcein-AM/PI染色显示该组死细胞最多；流式凋亡分析显示32.7%细胞处于晚期凋亡/焦亡阶段；Western blot证实GSDMD-NT表达，LDH释放最高，HMGB1减少；JC-1染色显示线粒体去极化，ROS水平升高，表明GSDMD-NT破坏线粒体并触发氧化应激。

3.6 通过eVNP@VPdM生物正交激活自噬抑制剂：Western blot分析p62/SQSTM1和LC3B表明，GSDMD-NT单独激活可诱导保护性自噬（LC3B-II升高、p62降低），而pro-MA经Pd催化生成的3-MA可抑制自噬（LC3B-II降低、p62累积），从而将细胞推向不可逆焦亡；Transwell实验显示联合处理组BMDC成熟比例最高达23%，说明焦亡与自噬抑制协同促进树突状细胞活化。

3.7 微流控平台上eVNP@VPdM在3D肿瘤球中的靶向和穿透评估：利用微流控芯片生成直径约220 μm的4T1肿瘤球，模拟肿瘤-血管界面；Z-stack共聚焦显示，在pH 6.5条件下，杂交膜包覆细菌的穿透深度显著增加；体内分布证实，与裸菌相比，eVNP@VPdM在肿瘤部位的荧光强度和菌落形成单位（CFU）更高。

3.8 eVNP@VPdM的强效抗肿瘤功效：在4T1荷瘤小鼠中，静脉注射mCherry标记的eVNP@VPdM后肿瘤内可见明显红色荧光；808 nm照射下肿瘤局部温度升至41.8 °C，足以激活基因表达且不损伤正常组织。治疗实验显示，单独激光或前药处理只有微弱抑瘤作用，而激光+pro-MA联合组肿瘤体积和重量显著降低，小鼠生存期延长；H&E、TUNEL和Ki67染色显示联合组凋亡最多、增殖最低；GSDMD表达增强而LC3表达降低，验证了体内焦亡诱导和自噬抑制。

3.9 eVNP@VPdM的抗肿瘤免疫激活：流式细胞术显示，联合治疗组成熟树突状细胞（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例从9.74%升至33.9%，CD8⁺ T细胞比例接近对照的2倍，调节性T细胞（Tregs）从28.4%降至6.06%；巨噬细胞M1/M2比值显著升高，血清IFN-γ和IL-1β水平上升；肿瘤组织免疫荧光显示CD8⁺ T细胞浸润增加。

讨论部分总结：本研究直接递送活性GSDMD-NT蛋白，避免了间接信号级联的复杂性；杂交膜伪装保留了CD47等免疫抑制信号，延长细菌循环时间；pH响应性VSV-G促进内化；NIR触发基因表达提高了时空精度；细菌裂解后形成的菌影进一步增强生物安全。Pd催化的生物正交反应可在肿瘤原位激活自噬抑制剂，阻断GSDMD-NT引起的保护性自噬，从而协同放大焦亡。

研究结论：研究人员提出一种基于工程菌递送平台的精准高效焦亡诱导策略，该多功能系统整合了激光诱导GSDMD-NT表达以实现时空可控焦亡、杂交膜伪装以增强免疫逃逸和细胞内化、Pd纳米颗粒光热转换及生物正交前药激活以增强疗效。这些协同机制在体外和体内均有效触发焦亡、破坏肿瘤生存途径并抑制肿瘤进展，为未来癌症免疫治疗提供了将微生物治疗、焦亡诱导和代谢干扰相结合的有前景的策略。