《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Isoliensinine targets NPC1 to reprogram lysosomal cholesterol and establish a reversible antiviral state
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胆固醇在胞内各膜结构间的空间分布决定了宿主对病毒感染的易感性，然而如何通过药理学手段调控这种空间组织以使原本允许病毒复制的细胞建立起抗病毒状态仍不清楚。本研究通过对甲型流感病毒感染的A549细胞进行单细胞转录组分析，研究人员鉴定出一个病毒受限的亚群，该亚群具有
胆固醇在胞内各膜结构间的空间分布决定了宿主对病毒感染的易感性，然而如何通过药理学手段调控这种空间组织以使原本允许病毒复制的细胞建立起抗病毒状态仍不清楚。本研究通过对甲型流感病毒感染的A549细胞进行单细胞转录组分析，研究人员鉴定出一个病毒受限的亚群，该亚群具有增强的胆固醇生物合成和动员能力，同时伴随着胆固醇在溶酶体中的优先积累。利用这一转录特征，研究人员发现双苄基异喹啉类生物碱异莲心碱是一种强效且可逆的溶酶体免疫代谢抗病毒状态诱导剂。异莲心碱促进胆固醇在溶酶体中发生可逆性聚集，并选择性地将先天免疫效应因子富集到这些细胞器中，从而阻断病毒的内吞作用和膜融合。从生化角度而言，异莲心碱以微摩尔级亲和力直接结合溶酶体胆固醇转运蛋白尼曼-匹克C1型蛋白，并破坏NPC1依赖的胆固醇外排。异莲心碱引发的抗病毒状态依赖于溶酶体主调控因子TFEB和完整的胆固醇依赖性通路，并在体外和体内对H1N1感染提供强有力的保护。总之，这些发现将NPC1确定为一个可成药的溶酶体检查点，并证明通过异莲心碱进行的瞬时药理学靶向作用可以可逆地重塑溶酶体胆固醇稳态和免疫效应因子的定位，而不会永久性损害NPC1功能，从而建立了一种灵活的宿主导向抗病毒策略。
研究背景与科学问题
溶酶体传统上被视为终末降解细胞器，但近年来越来越多证据表明其是先天免疫激活过程中动态重编程免疫系统的中枢枢纽。通过整合信号转导和代谢调节，溶酶体协调病原体感知、效应因子部署和代谢重连，从而快速组织空间化的免疫应答。胆固醇稳态，包括其合成、运输和亚细胞分布，对于维持膜的流动性、曲度和信号传导能力至关重要。许多包膜病毒，如埃博拉病毒、甲型流感病毒和冠状病毒，都利用富含胆固醇的内吞溶酶体膜来促进进入、融合和复制。尼曼-匹克C1型蛋白是一个位于晚期内体/溶酶体的多次跨膜蛋白，负责将胆固醇从溶酶体输出至其他细胞膜。除了脂质运输功能，NPC1已被确定为病毒进入的宿主因子，其遗传缺陷或药理学抑制可使细胞对多种病毒产生抵抗力，这与溶酶体胆固醇蓄积有关。然而，如何将这种本质上病理性的、储存障碍样的状态转化为短暂、可控且有治疗价值的抗病毒程序，仍是一个悬而未决的问题。为此，研究人员开展了此项研究，旨在探索通过靶向NPC1实现可逆性抗病毒状态的可能性。
研究方法与技术路线
研究人员首先重新分析了公开的甲型流感病毒感染A549细胞的单细胞RNA测序数据，采用Seurat包进行无监督聚类和差异基因分析。随后，基于连接图谱策略筛选模拟病毒受限亚群转录特征的小分子化合物。在机制验证中，综合运用了溶酶体免疫沉淀联合定量蛋白质组学、表面等离子体共振和生物层干涉测量法测定药物-靶蛋白直接结合、细胞热转变分析和药物亲和反应靶标稳定性实验验证细胞内结合、以及CRISPR-Cas9基因敲除技术进行功能验证。体内实验采用C57BL/6J小鼠和杂合Npc1+/-小鼠模型，通过鼻内给药评估异莲心碱的抗病毒效果。
研究结果
3.1 单细胞分析鉴定出病毒抵抗细胞中富含胆固醇的免疫代谢程序
通过重新分析H1N1感染A549细胞的scRNA-seq数据集，研究人员鉴定出一个病毒RNA含量低的亚群，该亚群显著上调了胆固醇生物合成和动员相关通路，包括MVD、SREBF1、SREBF2和LSS等关键调控因子和酶的表达。流式细胞术证实，低NP表达的细胞亚群确实表现出显著升高的胞内胆固醇水平，建立了胆固醇升高与病毒限制之间的单细胞关联。
3.2 溶酶体整合胆固醇再分布和免疫效应因子装载以协调抗病毒防御
研究发现H1N1感染和IFNβ处理均能显著提升总胞内胆固醇水平，且胆固醇优先在溶酶体中积累而非内质网。胆固醇耗竭会削弱IFNβ的抗病毒活性。两种刺激还促进了TFEB核转位和LAMP1表达增加，即溶酶体生物发生。单独诱导溶酶体生物发生的4-OI也能抑制H1N1复制。溶酶体蛋白质组学分析显示，刺激后溶酶体选择性富集了IFITM3等抗病毒效应蛋白，而胞浆ISG蛋白OAS1则未进入溶酶体。
3.3 异莲心碱触发溶酶体胆固醇蓄积并在体外展现广谱抗病毒活性
通过连接图谱筛选，研究人员发现双苄基异喹啉类生物碱异莲心碱是最强的溶酶体胆固醇蓄积诱导剂。异莲心碱剂量和时间依赖性地抑制H1N1、VSV和EMCV的复制，对H1N1的选择性指数高达109.6，且能减轻病毒诱导的细胞死亡。
3.4 TFEB和胆固醇依赖的溶酶体重塑介导异莲心碱诱导的免疫代谢抗病毒状态并阻断病毒进入
异莲心碱处理的溶酶体蛋白质组变化与H1N1感染高度相关。异莲心碱促进TFEB核转位和溶酶体生物发生，并增强IFITM3等溶酶体ISG蛋白的丰度。Tfeb敲除显著减弱了异莲心碱的抗病毒效果。胆固醇耗竭消除了异莲心碱的抗病毒作用，而补充胆固醇则恢复其活性。时间加药实验表明，异莲心碱主要在病毒进入阶段发挥作用，不影响病毒结合但显著抑制病毒内化。
3.5 异莲心碱处理保护小鼠免受H1N1感染
在C57BL/6J小鼠模型中，异莲心碱鼻内给药预处理显著提高了H1N1攻毒后的存活率，减轻了肺部炎症细胞浸润、血管渗漏和总蛋白浓度，降低了BALF中TNF-α和IL-1β水平，减少了肺病毒载量和NP蛋白表达，micro-CT也显示肺实变区域减少。
3.6 异莲心碱直接结合NPC1以模拟药理学NPC1抑制并驱动溶酶体免疫代谢活化
异莲心碱处理的转录组与已知NPC1抑制剂U18666A高度相似。CETSA和DARTS实验证明异莲心碱在细胞内稳定NPC1蛋白。SPR和BLI独立证实异莲心碱以微摩尔级亲和力直接结合重组人NPC1蛋白。生物素标记的异莲心碱在溶酶体中与NPC1共定位，且竞争实验显示特异性结合。在Npc1敲除细胞中，异莲心碱无法上调脂代谢基因、无法诱导TFEB核转位，其抗病毒效果显著降低。
3.7 NPC1是异莲心碱诱导的溶酶体重编程和体内抗病毒保护所必需的
Npc1+/-杂合小鼠的肺泡巨噬细胞呈现与异莲心碱处理野生型小鼠相似的溶酶体胆固醇蓄积表型，且肺组织中IFITM3表达升高。与野生型相比，Npc1+/-小鼠本身对H1N1感染具有更强的抵抗力，表现为更低的血管渗漏、炎症因子水平和病毒载量。异莲心碱在Npc1+/-小鼠中未能进一步提供额外保护，证实其体内抗病毒作用依赖于NPC1。此外，异莲心碱诱导的溶酶体胆固醇蓄积在撤药后24小时可逆，区别于遗传性NPC1缺陷的不可逆病理状态。
讨论与结论总结
本研究的讨论部分指出，研究人员结合单细胞转录组学、溶酶体靶向蛋白质组学、生化靶点鉴定和体内感染模型，定义了一种溶酶体免疫代谢抗病毒状态，并确立了异莲心碱通过靶向NPC1诱导该状态的药理探针角色。研究结果表明，病毒抵抗细胞在甲型流感病毒感染期间表现出增强的胆固醇生物合成和动员，伴随胆固醇在溶酶体中的优先积累。H1N1感染和IFNβ刺激均汇聚于相似的溶酶体表型，其特征为TFEB依赖的溶酶体生物发生、胆固醇富集以及IFITM3等抗病毒效应因子选择性装载入溶酶体。异莲心碱通过直接结合NPC1模拟并放大了这一溶酶体程序，驱动溶酶体胆固醇蓄积和TFEB激活，从而在体外阻断胆固醇依赖的病毒进入，并在体内赋予对H1N1的保护。这些发现将NPC1确立为一个可成药的溶酶体检查点，可通过瞬时干预重编程溶酶体免疫代谢为可逆的抗病毒状态。研究结论部分可翻译为：总之，这些发现将NPC1确定为一个可成药的溶酶体检查点，并证明通过异莲心碱进行的瞬时药理学靶向作用可以可逆地重塑溶酶体胆固醇稳态和免疫效应因子的定位，而不会永久性损害NPC1功能，从而建立了一种灵活的宿主导向抗病毒策略。该论文发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》。
