哥伦比亚多种革兰阴性菌中同时携带blaKPC-2、blaNDM-1与blaVIM-24碳青霉烯酶基因的IncC质粒的出现与播散

《JAC-Antimicrobial Resistance》：Emergence and dissemination of an IncC plasmid co-harbouring blaKPC-2, blaNDM-1 and blaVIM-24 carbapenemase genes across multiple Gram-negative species in Colombia

　　

目的：耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（CRGNB）构成公共卫生威胁，其威胁日益由质粒介导的碳青霉烯酶基因播散所驱动。作为哥伦比亚基因组监测项目的一部分，研究人员旨在鉴定共同携带多种碳青霉烯酶基因的CRGNB，并确定其遗传背景。 方法：研究人员采用靶向碳青霉烯酶的qPCR对2011–2023年间收集的832株耐碳青霉烯分离株进行筛查。对10株共同携带blaKPC、blaNDM和blaVIM的分离株进行了抗菌药物敏感性试验、长读长全基因组测序（WGS）、比较基因组学及接合转移试验。 结果：来自哥伦比亚地理上相距遥远的医院中无流行病学关联患者的9株肠杆菌目（Enterobacterales）分离株和1株豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）分离株携带高度相关的IncC质粒，大小范围为160–317 kb。这些质粒在三个保守的多重耐药区域（MDRr）内共同携带blaKPC-2、blaNDM-1和blaVIM-24，包括一个携带blaNDM-1和blaVIM-24的Tn21相关区域，以及一个Tn6454相关的blaKPC-2平台，此外还包含1型整合子、插入序列及多种其他抗菌药物耐药决定簇。10株分离株对多种β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）复方制剂耐药，其中5株对头孢地尔耐药。氨曲南/阿维巴坦对所有分离株仍保持活性；多黏菌素耐药仅限于天然耐药的雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri）和萨鲁曼沙雷菌（Serratia sarumanii）。接合转移试验证实质粒可转移至大肠埃希菌（Escherichia coli）J53，测序确认转移了一个179 kb的IncC质粒，该质粒具有功能性接合转移机制。比较基因组学分析显示，该IncC质粒骨架在多个菌种间高度保守，支持该耐药平台的广泛播散。 结论：这是单个质粒同时携带三种碳青霉烯酶基因的首次报道。该发现凸显了多重耐药（MDR）革兰阴性病原体跨菌种播散的一个令人担忧的机制，并强调了以高风险质粒为重点的长读长基因组监测的重要性。

论文解读

一、研究背景与问题

耐碳青霉烯革兰阴性杆菌（CRGNB）因其有限的治疗选择，已成为全球重大公共卫生威胁。碳青霉烯酶包括丝氨酸碳青霉烯酶（如KPC、OXA-48）和金属-β-内酰胺酶（MBL，如NDM、VIM），已在全球范围内广泛播散。碳青霉烯酶基因通过成功的细菌谱系和移动遗传元件（MGEs），如质粒和转座子，实现传播。在哥伦比亚，KPC-2于2005年首次报道并已成为地方性流行，随后VIM于2011年、NDM于2013年相继出现。bla_KPC-2仍是肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）分离株中最主要的碳青霉烯酶基因，尤其见于高风险克隆ST307和ST1082，而bla_KPC-3与ST11密切相关。这些克隆通常携带多种质粒类型，如IncC和IncF复制子类型。

过去十余年间，美国、欧洲和拉丁美洲陆续有零星报道共同产生双碳青霉烯酶的CRGNB，这些组合最常见涉及一种丝氨酸碳青霉烯酶加一种MBL，由于其对β-内酰胺酶抑制剂的不同敏感性谱，从而扩大了β-内酰胺耐药范围。尤为令人担忧的是，在哥伦比亚，共同携带多种碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌比例显著上升，从2018年的1.1%升至2024年约50%的受检分离株共同产生KPC和NDM。头孢他啶/阿维巴坦和美罗培南/法硼巴坦的引入为产丝氨酸β-内酰胺酶的菌株提供了更多治疗选择，但共同携带MBL的分离株日益增多，正威胁这些疗法的有效性，极大限制了治疗选择。

关于动员多种碳青霉烯酶基因的遗传元件的信息有限，阻碍了对它们播散机制的理解。长读长测序能够重建菌株内耐药决定簇的基因组背景，从而确定它们是像常见情况那样位于不同质粒上，还是共定位于同一遗传元件上。本研究利用一个大型全国性临床相关CRGNB基因组监测收集，鉴定了共同产生多种碳青霉烯酶的临床分离株，并表征了一种新型可接合转移IncC质粒，该质粒在哥伦比亚多家医院回收的多种革兰阴性菌种中共同携带bla_KPC-2、bla_NDM-1和bla_VIM-24。

二、研究设计与技术方法

研究人员在RAEH（抗菌药物耐药性与医院流行病学研究组）框架内，对2011–2023年间从哥伦比亚17个城市37家医院收集的832株临床或携带状态CRGNB分离株进行了碳青霉烯酶基因的qPCR筛查。10株经NG-test^? CARBA5免疫测定确认同时携带三种不同碳青霉烯酶的分离株被纳入本研究。研究采用的关键技术方法包括：使用Sensititre EUMDRXXF面板和UMIC头孢地尔试纸条测定最低抑菌浓度（MIC），并采用梯度扩散法测定氨曲南/阿维巴坦的MIC；以肺炎克雷伯菌UEB72（最早分离株）与大肠埃希菌J53进行接合转移试验；使用Oxford Nanopore Technologies长读长测序技术（Sequencing by Ligation kit V14和R10.4.1流动池）对10株临床分离株及转接合子进行全基因组测序；采用Flye（v2.9.4）进行组装，Medaka（v1.12.1）进行校正，并利用Center for Genomic Epidemiology数据库和工具（MLST v2.0.9、ResFinder v2.4.0、PlasmidFinder v2.2.0）及MOB-Suite（V3.1.9）进行注释；采用Ridom SeqShere+（v10.5.0）进行cgMLST分析；使用ProkSee（build 2026–02–25）进行质粒比对和区域可视化。

三、研究结果

分离株特征与系统发育分析：10株持续携带bla_KPC-2、bla_NDM-1和bla_VIM-24的分离株来自哥伦比亚各地医院的成年患者，最早可追溯至2019年。这些分离株包括5株肺炎克雷伯菌（Kpn）、1株产气克雷伯菌（Kae）、1株霍氏肠杆菌（Eho）、1株雷氏普罗威登斯菌（Pre）和1株萨鲁曼沙雷菌（Ssa，属于粘质沙雷菌复合群），均与临床感染相关，以及1株豚鼠气单胞菌（Acv）来自直肠筛查。基因组分析显示，肺炎克雷伯菌分离株属于不同的遗传谱系：ST987（Kpn_UEB72）、ST17（Kpn_UEB62）、ST1441（Kpn_UEB50）和ST307（Kpn_UEB85和Kpn_UEB87，基于cgMLST相差11个位点）。

抗菌药物耐药表型：所有分离株均呈多重耐药（MDR）表型，对β-内酰胺类广泛耐药，包括新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL/BLI）复方制剂头孢他啶/阿维巴坦、亚胺培南/瑞来巴坦和美罗培南/法硼巴坦，但对氨曲南/阿维巴坦保持敏感。5株分离株（3株肺炎克雷伯菌UEB72、UEB50和UEB62，雷氏普罗威登斯菌UEB89和萨鲁曼沙雷菌UEB92）对头孢地尔耐药。所有分离株对多黏菌素保持敏感，但天然耐药的雷氏普罗威登斯菌和萨鲁曼沙雷菌除外。

质粒基因组学分析：全基因组测序使比较基因组学分析得以揭示三重碳青霉烯酶产生的遗传背景。所有10个基因组均携带一个高度保守的IncC质粒骨架，其上携带bla_KPC-2、bla_NDM-1和bla_VIM-24。大多数IncC质粒大小为160–179 kb，但Kae_UEB75中为251 kb，Kpn_UEB50中为317 kb的多复制子质粒例外。以来自最早分离株的178 kb质粒Kpn_UEB72为参考，所有分离株中观察到高度保守的结构。鉴定出三个多重耐药区域（MDRr），包含成簇的抗菌药物耐药基因和MGEs。MDRr1包含一个Tn₂₁相关区域，含四个模块：（i）一个1型整合子（dfrA17、aac(6')-Ib-cr、bla_OXA-1、catB3、arr-3），（ii）两侧为IS₉₁和IS₄₃₂₁的bla_NDM-1，（iii）另一个1型整合子（bla_VIM-24、aac(6')-II、catB3、ant(2'')-Ia、aph(2'')-VIa和sul1），以及（iv）IS₁₃₅₃和汞抗性操纵子merEDCPTR。MDRr2包含一个Tn₆₄₅₄相关的bla_KPC-2平台，含Δbla_TEM、tnpR和tnpA基因。MDRr3携带砷、大环内酯类（msr(E)、mph(E)和ermD）和磺胺类（sul2）耐药决定簇，两侧为IS₆和IS₉₁。

接合转移实验：在接合转移试验中，肺炎克雷伯菌UEB72成功将质粒转移至大肠埃希菌J53（接合频率：4.4×10^?3），对转接合子进行的全基因组测序确认存在一个179 kb的IncC质粒，共同携带三种碳青霉烯酶基因，并包含转移相关特征，包括oriT、MOBH松弛酶、IV型偶联蛋白、IV型分泌系统以及用于质粒稳定性的higBA毒素-抗毒素系统。

四、讨论与结论

研究人员通过筛查一个大型全国性CRGNB基因组监测收集，鉴定出一种哥伦比亚新出现的高风险质粒。分析揭示了一种新型IncC质粒，在来自哥伦比亚地理上相距遥远医院的6个不同菌种中共同携带bla_KPC-2、bla_NDM-1和bla_VIM-24基因。该质粒在无明确时空关联的全国医疗机构中被检出（除两株密切相关的ST307分离株外），提示其广泛而成功的播散。研究结果表明该质粒具有广宿主范围和自主接合转移能力。它携带多个不同的多重耐药区域，包括一个同时携带bla_NDM-1和bla_VIM-24的Tn₂₁相关区域，以及一个非Tn₄₄₀₁的bla_KPC-2平台（Tn₆₄₅₄）。据研究人员所知，三种碳青霉烯酶基因共定位于单个质粒上此前尚未有报道。

bla_NDM-1、bla_KPC-2和bla_VIM-24在单个质粒上的组合与哥伦比亚的分子流行病学一致，因为（i）KPC为地方性流行，（ii）MBL报告日益增多，（iii）IncC质粒与革兰阴性菌的抗菌药物耐药广泛相关。全球范围内，双碳青霉烯酶产生菌的报道频率正在增加。2012至2019年间，美国CDC记录了超过150例携带多种碳青霉烯酶基因的肠杆菌目细菌病例，常与海外医疗暴露相关。然而，这些报告未明确基因是否位于同一质粒上。在多个碳青霉烯酶地方性流行的国家，同一菌株中已鉴定出多种碳青霉烯酶基因，但通常位于不同的遗传元件上。

本研究中，3株肺炎克雷伯菌、霍氏肠杆菌和雷氏普罗威登斯菌分离株还携带额外的bla_KPC拷贝（包括bla_KPC-3），而豚鼠气单胞菌携带额外的bla_VIM-24拷贝，位于单独的质粒或染色体上。三种碳青霉烯酶基因在单个质粒上的共定位代表了革兰阴性菌耐药进化的又一步，显著增加了质粒介导的基因跨菌种转移潜力。丝氨酸碳青霉烯酶与MBL的组合构成重大临床挑战。虽然头孢他啶/阿维巴坦和美罗培南/法硼巴坦对产KPC的肠杆菌目有效，但当MBL共同产生时其活性受损。氨曲南/阿维巴坦对所有10株分离株保持低MIC活性，但其在许多中低收入国家可及性有限，构成重大问题。多黏菌素仍是唯一广泛可及的有效选择，但临床疗效有限。尽管5株分离株对头孢地尔耐药，但该表型未通过接合转移从肺炎克雷伯菌UEB72转移至大肠埃希菌J53，表明至少在该分离株中，该耐药并非严格质粒编码。

本研究强调了长读长测序对高度耐药CRGNB基因组监测的价值，能够准确重建完整质粒并检测共定位的耐药基因、MGEs和跨多样宿主的质粒骨架。此类能力对于追踪和监测高风险质粒（如本文所述）至关重要。需要进一步研究以阐明该元件的起源、传播动态和持久性。持续的基因组监测、感染控制措施和抗菌药物管理计划对于遏制这些病原体的播散至关重要。