《Protein Expression and Purification》：Simplified Chromatography-based Purification approach with utilizing Tangential Flow Filtration for Colorectal Cancer Biomarker: Carcinoembryonic Antigen
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摘要癌胚抗原（CEA）是癌症诊断和预后的重要临床生物标志物，尤其对结直肠癌具有重要意义。本研究提出了一种简化的方法，从结直肠癌患者的腹水中纯化天然CEA抗原。此外，该技术能够在保证CEA结构和功能完整性得以保存的前提下对其进行表征。CEA的纯化通过高氯酸沉淀、切向流过滤和连续
摘要
癌胚抗原（CEA）是癌症诊断和预后的重要临床生物标志物，尤其对结直肠癌具有重要意义。本研究提出了一种简化的方法，从结直肠癌患者的腹水中纯化天然CEA抗原。此外，该技术能够在保证CEA结构和功能完整性得以保存的前提下对其进行表征。CEA的纯化通过高氯酸沉淀、切向流过滤和连续层析来实现。分离得到的CEA相对分子质量约为200 kDa，并通过SDS-PAGE、体积排阻FPLC和免疫印迹进行分析，证实其纯度与天然CEA蛋白参考品相当。经胰蛋白酶消化并去糖基化后的CEA抗原进行肽质量指纹谱鉴定，确认其为CEACAM5_HUMAN（Uniprot ID：P06731）。该方法展示了可适应较大体积样本的操作灵活性，以及生产天然CEA蛋白的实用性，对于未来的诊断应用、临床研究和生物分析研究具有潜在价值。
引言
癌胚抗原（CEA）又称CD66e，由CEACAM5（癌胚抗原相关细胞粘附分子5）基因编码。它是一种膜相关糖蛋白，存在于细胞表面，通过糖基磷脂酰肌醇键与质膜相连[1]；同时，它属于癌胚抗原相关细胞粘附分子（CEACAM）家族，该家族是免疫球蛋白超家族（IgSF）的一部分[2]。由于CEA广泛糖基化，碳水化合物约占CEA总质量的50%~60%，使其分子量在180~200 kDa范围内[3]、[4]。在健康的结直肠组织中，CEA位于上皮细胞的顶端表面，并可释放到细胞外空间[5]、[6]。一旦从细胞表面脱落，它可能进入间质液，随后到达血液循环，从而可通过免疫测定方法在癌症患者中进行检测[7]。正常血清CEA水平通常为0~2.5 ng/mL，吸烟者的水平略有升高（可达5 ng/mL）[8]、[9]。被诊断为结直肠癌（CRC）以及肺癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌的患者，其血清CEA浓度通常高于2.5 ng/mL[10]。在已确立恶性肿瘤的情况下，循环CEA水平是肿瘤负荷的指标，具有预后应用价值，可辅助疾病分期，并结合其他诊断工具和治疗策略为治疗决策提供参考[11]。
美国食品药品监督管理局（FDA）于1974年批准CEA用于癌症分期和监测[12]。CEA在结直肠癌中尤为重要，结直肠癌是全球第三大常见癌症和第二大癌症死因。2020年全球结直肠癌新发病例约190万例，死亡人数超过93万例。预计到2040年，结直肠癌年新发病例将达到320万例，增幅为63%；死亡率预计升至每年160万例，增幅为73%[13]。因此，癌症发病率的上升使得对精确CEA检测的需求日益增加，以促进早期发现、追踪复发和评估治疗效果[14]、[15]。酶联免疫吸附测定（ELISA）和电化学发光免疫测定（ECLIA）等免疫测定平台因其灵敏性和特异性而被广泛应用于定量分析。然而，这些检测方法的性能很大程度上取决于所用标准品或校准品的质量。因此，高纯度生物标志物蛋白的纯化至关重要，因为它能够保存天然结构表位，并可能在诊断应用中提供更高的分析可靠性。以往的研究已从肝转移肿瘤、血清和腹水中分离出天然CEA[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。虽然以往的研究在CEA的纯化和免疫化学表征方面取得了显著成果[16]、[17]、[18]、[19]、[20]，但这些历史制备品往往受到最终纯度百分比较低的局限[17]，或依赖于免疫电泳等定性评估方法[19]、[20]。它们缺乏现代诊断检测校准所需的定量纯度指标、SEC-HPLC分析和质谱鉴定[16]，这限制了其在标准化诊断应用中的使用。
在本研究中，从结直肠癌患者收集的腹水中分离天然CEA，腹水被视为一种生物废弃物。与肿瘤活检相比，腹水可以获取到显著更大的体积，使其在大规模纯化方面具有高度优势。该策略有助于提取高纯度CEA，适用于诊断检测的校准和验证。虽然可以生产重组CEA，但它可能缺乏天然的翻译后修饰和正确折叠，可能影响抗体识别。因此，高纯度天然CEA的可用性预计将提高检测灵敏度，改善疾病复发监测，并实现更早发现转移进展。
章节片段
材料与试剂
Nuvia Prime 4A购自Bio-Rad Laboratories（美国加利福尼亚州）；HiLoad 26/600 Superdex 200 pg凝胶过滤树脂购自Global Life Sciences Solutions（美国威尔明顿市）。商业癌胚抗原（CEA）参考标准品购自Lee Biosolutions（美国密苏里州）。Pellicon 2 Mini超滤模块（MWCO 30 kDa，货号P2C030C01）和Pellicon XL超滤模块（MWCO 30 kDa，货号PXB030A50）购自EMD Millipore公司。
含CEA抗原腹水的筛选与分选
血清、尿液和腹水等体液是富含生物标志物的宝库，能够反映正常或异常的生理状态[27]、[28]；疾病引起的体液变化可提供有关早期疾病发现和监测的信息[29]。腹水的蛋白质含量可以为潜在疾病状况提供线索。通常，蛋白质浓度在25 mg/mL及以上的腹水被认为是渗出液，通常与感染或恶性肿瘤有关。
讨论
此前的研究表明，人CEA可通过以结肠肿瘤肝转移灶作为初始原料进行特殊纯化[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。此外，少数研究人员使用卵巢癌患者的腹水、人体囊肿液、患者血清和肿瘤组织作为CEA来源[41]、[42]。
由于CEA是主要用于结直肠癌监测和预后评估的成熟生物标志物，本研究的关键优势在于专门使用腹水作为来源
结论
总之，本研究提出了一种简化的层析技术，从结直肠癌患者的腹水中纯化癌胚抗原（CEA），腹水作为CEA分离的创新且实用的来源，从而拓展了可用于蛋白纯化的样本基质范围。从层析角度来看，该方法具有操作简便、分辨率高和易于放大等特点，适合工艺优化和潜在应用
CRediT作者贡献声明
Kunal K. Shukla：验证、资源、方法论。Shraddha V. Prabhu：验证、方法论、形式化分析。Rohini S. Daftary：项目管理、资金获取。Vinoth P. Gunasekaran：撰写—审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理。Aruni Wilson Santosh Kumar：项目管理。Shamkent B. Badgujar：撰写—审阅与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、方法论、调查、形式化分析
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能对本研究报告工作产生影响的已知竞争财务利益或个人关系。
致谢
本研究由印度泰恩的Advy Biosciences私人有限公司提供资金支持。作者感谢我们的Siddharth Bharat Daftary总监对本项研究给予的鼓励。此外，作者对Narendra Pundalik Sawant先生在当前研究中提供的支持和激励表示衷心感谢。
Arti M. Rane | Shamkent B. Badgujar | Kunal K. Shukla | Rohini S. Daftary | Shraddha V. Prabhu | Aruni Wilson Santosh Kumar | Vinoth P. Gunasekaran
Amity生物技术学院，Maharashtra Amity大学，孟买-浦那快速路，Bhatan，Post Somathne，Panvel 410206，Maharashtra，印度
