TCRαβ库可塑性决定流感病毒HLA-A*02:01-PB1413–421表位特异性通用CD8+ T细胞应答

《The Journal of Immunology》：TCRαβ repertoire plasticity defines universal CD8+ T cell responses directed at influenza-specific HLA-A*02:01-PB1413–421 epitope

　　

HLA-A*02:01限制性PB1413⁺CD8⁺ T细胞提供了已报道的针对甲型、乙型和丙型流感病毒最广泛的交叉反应性免疫。在此，研究人员调查了这些通用A2/PB1413⁺CD8⁺ T细胞库内的T细胞受体（TCR）克隆型特征，并与免疫优势的甲型流感特异性M158⁺CD8⁺ T细胞以及共优势的乙型流感特异性A2/HA543⁺CD8⁺记忆T细胞进行了比较。利用单细胞逆转录聚合酶链反应和RNA测序方法，研究人员定义了TCRαβ库的组成和多样性。研究表明，响应这3种表位的CD8⁺ T细胞在数量以及TCRαβ库的基因使用和共享方面存在差异，其基础是每种肽-主要组织相容性复合体I类（pMHC-I）特异性所具有的特定TCR和结构特征。数据表明，A2/PB1413⁺CD8⁺ TCRαβ库在TCRα链和TCRβ链内都包含多样的基因区段使用。然而，这些使用在表达HLA-A*02:01的个体之间差异很大，并且在TRAV、TRBV、TRBJ和TRAJ基因区段中缺乏任何共享特征。这种A2/PB1413⁺CD8⁺ TCRαβ多样性源于较低的重组概率，归因于TCRβ链中大量N-插入。PB1413⁺CD8⁺ T细胞还表现出对A2/PB1413表位识别的显著可塑性，体现在不同表达HLA-A*02:01个体间对通用A2/PB1413表位的多样化CD8⁺ T细胞识别模式上。相反，A2/BHA543⁺CD8⁺和M158⁺CD8⁺ T细胞内的TCRαβ库显示出常见的TRAV、TRBV、TRBJ和TRAJ基因区段，在表达HLA-A*02:01的个体间共享，并识别A2/BHA543和A2/M158表位内的关键残基。总体而言，数据表明通用A2/PB1413⁺CD8⁺ T细胞内TCRαβ基因使用具有高度多样性，提示TCRαβ克隆可塑性定义了对人流感病毒的通用免疫。

研究背景：流感病毒每年造成显著的发病率和死亡率，现行流感疫苗因病毒高度变异而需每年更新。灭活疫苗主要通过诱导B细胞应答和抗体产生提供保护，但当疫苗株与流行株发生抗原错配时效果下降。相比之下，流感特异性记忆CD8⁺ T细胞能针对不同流感病毒株和亚型提供广泛交叉反应性免疫，甚至可识别新出现流感病毒。已有证据表明，流感特异性CD8⁺ T细胞的优势化与病毒滴度降低和疾病减轻相关；2013年H7N9禽流感暴发也凸显了预存记忆CD8⁺ T细胞在预防重症和死亡中的重要性。研究人员此前已证明CD8⁺ T细胞可对甲型、乙型和丙型流感病毒产生前所未有的交叉反应性，这对无需年度改款的通用疫苗设计具有重要意义。CD8⁺ T细胞的保护能力与其T细胞受体（TCR）识别肽-主要组织相容性复合体I类（pMHC-I）复合物的过程密切相关，TCRαβ库的性质，包括多样性、克隆优势性以及公有性或私有性，可能影响感染结局和免疫优势层级。因此，理解决定TCRαβ库特征的遗传和结构因素，对于T细胞疫苗和免疫治疗的理性设计十分重要。

研究人员围绕HLA-A*02:01限制的三种流感病毒CD8⁺ T细胞表位开展了系统比较：甲型流感保守的A2/M158表位、乙型流感保守的A2/BHA543表位，以及跨越甲、乙、丙型流感病毒的通用A2/PB1413表位。研究首次报道了A2/BHA543和A2/PB1413的TCRαβ库特征，发现针对这3种表位的CD8⁺ T细胞在数量、TCRαβ基因使用和共享程度上均存在差异，这些差异由各pMHC-I特异性所对应的TCR遗传特征和结构特征支撑；同时，这3种CD8⁺ T细胞的功能质量均未受损。该研究为理解TCRαβ库的遗传和结构基础提供了新见解，对基于T细胞的通用疫苗设计具有重要意义。

关键技术方法方面，研究人员使用了以下主要方法：基于GenBak等数据库序列进行表位保守性比对；采用四聚体相关磁富集（TAME）直接离体检测外周血单个核细胞中的表位特异性CD8⁺ T细胞；通过单细胞分选、多重巢式逆转录PCR和单细胞RNA测序获取配对TCRαβ序列，并使用TCRdist分析基因区段使用、CDR3长度及插入/删除；使用IGoR计算TCR生成概率（Pgen）；利用X射线晶体学解析HLA-A*02:01-PB1413和HLA-A*02:01-BHA543复合物结构；通过野生型、D227K和Q115E四聚体检测pMHC-I/TCR亲合力，通过细胞内细胞因子染色（ICS）检测多功能性，通过肽滴定和丙氨酸扫描评估功能亲合力和关键识别残基。样本来源包括健康供者和经PCR确诊的甲型或乙型流感患者，健康供者来自墨尔本大学或澳大利亚红十字会Lifeblood，流感患者来自Alfred医院、皇家墨尔本医院和St Jude儿童研究医院FLU09队列。

研究结果如下：

免疫优势层级：通过TAME对健康个体和流感患者的离体PBMC进行检测，A2/M158⁺CD8⁺ T细胞在健康个体和甲流患者中频率显著高于A2/PB1413⁺和A2/BHA543⁺CD8⁺ T细胞，后两者在乙流感染后呈共优势状态。健康个体中约83%和78%分别可检出A2/PB1413⁺和A2/BHA543⁺CD8⁺ T细胞，而A2/M158⁺CD8⁺ T细胞在全部健康个体和甲流患者中均可检出。

克隆型多样性：对单细胞TCRαβ测序数据进行Circos图、弦图和核主成分分析后发现，A2/PB1413⁺CD8⁺ TCRαβ库在TRAV、TRBV、TRAJ和TRBJ基因使用上高度多样，且在不同个体间缺少共享克隆型，表现为私有性；A2/BHA543⁺CD8⁺ TCRαβ库则存在TRBV4-3/TRAV29等常见基因配对，但克隆型仍以私有为主。这与A2/M158⁺CD8⁺ T细胞中公有TRBV19/TRAV27克隆型的特征形成鲜明对比。

低概率TCR生成：利用IGoR计算Pgen后发现，A2/PB1413特异性TCRαβ的生成概率显著低于其他多数特异性，主要受TCRβ链限制，其CDR3β区含有显著更多的N-插入，且N-插入数目与TCRαβ Pgen呈负相关。

CDR3长度和基序特征：A2/PB1413 TCRαβ库的CDR3长度偏倚较弱，仅在CDR3α中富集少量非胚系编码的天冬氨酸，未发现显著的CDR3β公共基序；A2/BHA543 TCRαβ库则具有明显的CDR3β长度偏倚，并在CDR3β和CDR3α中分别富集精氨酸以及异亮氨酸/亮氨酸基序。

晶体结构特征：HLA-A*02:01-PB1413复合物结构显示PB1413肽以延伸构象结合，表面相对平坦且缺乏突出特征；HLA-A*02:01-BHA543复合物结构则显示BHA543肽具有多个溶剂暴露残基，尤其是P5-组氨酸和P4-天冬酰胺，形成可供TCR识别的结构特征。

PB1413表位的多样化识别：丙氨酸扫描实验显示，5名个体对PB1413肽各残基突变的CD8⁺ T细胞应答模式各不相同，提示不同个体采用不同TCR基因区段的克隆型通过不同方式识别同一相对平坦的表位。

BHA543表位的聚焦识别：丙氨酸扫描显示，所有检测个体对BHA543肽P5-组氨酸突变均丧失应答，P4-天冬酰胺突变则普遍降低应答，说明识别集中于该表位突出的结构特征。

功能质量：尽管A2/PB1413⁺和A2/BHA543⁺CD8⁺ T细胞的多功能性低于A2/M158⁺CD8⁺ T细胞，但三者的pMHC-I/TCR亲合力相当，且A2/PB1413⁺和A2/BHA543⁺CD8⁺ T细胞具有更高的功能亲合力，中位半数有效浓度分别为0.89 nM和0.79 nM，而A2/M158⁺为8.1 nM，表明低概率TCR生成并未限制这些CD8⁺ T细胞的功能。

讨论总结：A2/PB1413⁺CD8⁺ T细胞的TCRαβ库具有跨个体的基因使用可塑性和私有性，其低生成概率与TCRβ链大量N-插入相关，而非由pMHC-I结构特征决定；A2/BHA543⁺CD8⁺ T细胞虽存在跨个体共享的基因配对，但克隆型仍以私有为主，并与表位突出的结构特征相关；A2/M158⁺CD8⁺ T细胞则以公有TRBV19克隆型及其CDR3β基序为特征。研究还提示，TCR克隆型共享程度可能与群体中该表位应答的检出率相关，但TCR库性质本身不一定决定免疫优势层级，抗原负荷和递呈效率等因素也可能参与其中。研究结论可翻译为：总体而言，数据表明通用A2/PB1413⁺CD8⁺ T细胞内存在高水平TCRαβ基因使用多样性，说明TCRαβ克隆可塑性定义了针对人流感病毒的通用免疫。