全外显子组与全基因组测序鉴定婴儿肾骨化性肿瘤中的CTNNB1驱动突变

《The American Journal of Surgical Pathology》：Whole-Exome and Whole-Genome Sequencing Identifies Driver CTNNB1 Mutations in Ossifying Renal Tumor of Infancy

　　

婴儿肾硬化性肿瘤（ORTI）是一种极其罕见的儿童肾脏肿瘤，其临床病程本质上为良性。尽管其组织形态学特征已被充分描述，但其潜在的分子发病机制在很大程度上仍不清楚，在将其与恶性类似疾病（如肾母细胞瘤和细胞性先天性间叶性肾瘤）进行鉴别时，往往会造成诊断困难。在此，我们系统评估了4例男性婴儿（年龄0.5至10个月，中位数：2.5个月）的ORTI的临床病理、免疫组织化学及基因组学特征，所有患者均表现为肉眼血尿。组织学上，所有肿瘤均表现出特征性的双相结构，由富含类骨质/成骨细胞的成分与温和的梭形细胞成分交错组成，伴不同程度的钙化、局灶性芽状组织样灶和分叶状生长模式。免疫组织化学染色显示，所有病例（4/4，100%）在两种成分中均呈现强而弥漫的核内β-catenin蓄积，同时WT1和SATB2呈弥漫性核阳性，细胞周期蛋白D1呈局灶性表达。Ki-67增殖指数呈现明显的梯度差异，梭形细胞成分（5%至30%）始终高于类骨质区域（2%至15%）。所有肿瘤均对pan-TRK、ALK、CD34、S100和PAX8呈阴性。下一代测序（NGS）（全基因组测序/全外显子组测序）在100%的病例（4/4）中鉴定到CTNNB1第3外显子的反复发生的体细胞激活热点突变（c.A121G，p.T41A），与核内β-catenin定位完美对应。同时检测到Wnt通路调节因子（APC、AXIN1/AXIN2）和BMPR1A的次级改变，而FISH证实不存在ETV6::NTRK3基因重排。所有患者在完全手术切除后均实现了长期无病生存（随访长达10年）。总之，ORTI是一种独特的、由CTNNB1驱动的儿童肾脏肿瘤，其定义为反复发生的第3外显子热点突变和异常的核内β-catenin表达。识别这些病理特征性的分子和免疫表型标志物，建立了稳健的诊断标准，以明确区分ORTI与恶性儿童肾脏类似病变。

儿童群体呈现出多种多样的肾脏肿瘤，从常见的神经母细胞瘤和肾母细胞瘤，到较少见的恶性肿瘤如肾细胞癌。婴儿肾硬化性肿瘤（ORTI）是一种极其罕见、通常呈良性的肾脏肿瘤，主要表现为无痛性肉眼血尿，较少出现可触及的腹部肿块。放射学检查中，超声、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）特征性显示肾脏轮廓保存完整，肾盂内含有钙化或骨化的肿块。组织学上，ORTI呈现出令人瞩目的独特模式，由不同比例的类骨质材料、显著的成骨细胞和温和的梭形细胞组成。由于其极度稀少以及与钙化性肾母细胞瘤或其他成骨性间叶肿瘤在形态学上的重叠，ORTI可能给病理医师带来重大诊断陷阱。

自Chatten等人于1980年首次描述以来，ORTI一直是一种临床病理学上的罕见病例，迄今为止文献中仅报道了有限数量的病例。目前，ORTI的诊断完全依赖于这些已充分记录的临床和组织形态学特征；然而，这种罕见肿瘤的潜在组织发生学和分子发病机制仍然完全未知。近年来，高通量测序和分子分析技术的整合从根本上改变了我们对罕见肿瘤的认识。ORTI的分子景观仍未被探索，其独特的硬化表型是否由特定的反复突变驱动也尚未确定。值得注意的是，一项病例报告首次通过全外显子组测序（WES）在ORTI中发现了CTNNB1突变。

在我们机构的会诊实践中，我们遇到了4例具有长期临床随访的儿童ORTI病例。通过利用全基因组测序和全外显子组测序（WES）并匹配正常对照，我们证实反复发生的CTNNB1第3外显子热点突变是所有病例一致且定义性的分子特征。为进一步表征该实体，本研究系统调查了这4例病例的临床病理、免疫组织化学（IHC）和基因组学特征。通过将CTNNB1突变状态与形态学和免疫表型进行关联，我们旨在阐明ORTI的组织发生学并建立稳健的分子标准，以促进其精确诊断和与组织学类似病变的鉴别。

**材料与方法**

**病例选择**

在苏州大学儿童医院和浙江大学医学院附属儿童医院的病理记录中，共识别出4例经分子确诊的婴儿肾硬化性肿瘤（ORTI）。相关临床数据和患者随访结果通过医院电子病历系统和与转诊医师的沟通获得。

所有可用的苏木精-伊红（H&E）染色切片均由2名经验丰富的儿童病理医师独立审查以确认诊断。对所有肿瘤进行了系统的组织学和形态学特征评估，包括肿瘤组织成分（类骨质材料、成骨细胞和梭形细胞的比例）、细胞形态学、核异型性、有丝分裂象、血管增生、骨化、钙化和胶原化。本研究经苏州大学儿童医院和浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会（IRB）批准。所有患者在纳入研究前均取得了其法定监护人的知情同意。

**免疫组织化学**

IHC染色使用Leica自动免疫染色仪（Leica Biosystems）按照制造商优化的方案在4μm厚的石蜡包埋（FFPE）全切片上进行。为便于诊断和鉴别诊断，使用了抗体组合，包括：β-catenin、WT1、p53、Ki67、S100、CD34、PAX8、细胞周期蛋白D1、SATB2和pan-TRK。抗体克隆、供应商和稀释比例的完整细节汇总于补充表1，补充数字内容1，https://links.lww.com/PAS/C436。每批同时运行适当的阳性组织对照和阴性组织对照。

对于一般标记物，根据染色肿瘤细胞的百分比进行半定量评估：若未观察到染色（或少于1%）则视为阴性；若肿瘤细胞中1%至50%呈现染色则视为局灶阳性；若超过50%的肿瘤细胞呈现染色则视为弥漫阳性。染色强度分级为弱、中等或强。Ki67增殖指数通过计数热点中阳性细胞核的百分比进行半定量评估。

关键的是，鉴于通过测序鉴定的CTNNB1突变，β-catenin表达被严格分类为正常/野生型（局限于膜染色）或异常（呈现明显的核和/或胞质蓄积）。

**下一代测序（NGS）（WGS和WES）**

为阐明这些肿瘤的分子景观，对4例ORTI进行了NGS。从FFPE肿瘤组织切片中提取基因组DNA。为有效滤除胚系多态性并精确鉴定体细胞改变（BGI DNBSEQ，中国），同步对匹配的患者外周血或邻近正常非肿瘤组织进行测序，作为每例的胚系对照。

基因组分析策略如下：病例1接受高深度全基因组测序（WGS）以获得无偏的基因组范围覆盖。病例2、3和4接受全外显子组测序（WES），以匹配的邻近正常组织作为对照。对于WES，利用混合捕获式目标富集技术选择性捕获和富集基因组范围内的蛋白编码外显子序列，随后在Illumina平台上进行高通量测序。

采用标准化的生物信息学流程进行数据处理和体细胞改变检测。简言之，原始测序读段经过质量控制并与人类参考基因组组装hg38（GRCh38）进行比对。通过将肿瘤样本与其配对的正常对照进行比较来鉴定体细胞变异（包括单核苷酸变异SNVs、小插入/缺失indels和拷贝数变异CNVs），以排除胚系多态性和技术假象。

变异注释使用基于RefSeq转录本模型的ANNOVAR进行，变异命名符合人类基因组变异学会（HGVS）标准。人群等位基因频率从权威公共数据库检索，包括千人基因组计划、外显子组聚集联盟（ExAC）和基因组聚集数据库（gnomAD）。进一步的计算机功能预测工具（SIFT、PolyPhen-2、CADD）用于评估错义变异的潜在致病影响。

**荧光原位杂交（FISH）**

在4μm厚的未染色FFPE切片上进行中期FISH，以筛查ETV6::NTRK3基因融合。该实验使用ETV6::NTRK3双色断裂探针（安必平，广州，中国）严格按照制造商优化方案进行。简言之，肿瘤切片经脱蜡、预处理后与探针共变性，随后在湿化箱中过夜杂交。切片经严格性洗涤去除未结合的探针，并以DAPI复染。荧光信号使用Nikon荧光显微镜（Nikon，东京，日本）进行可视化、分析和捕获。每个样本至少评估100个不重叠、完整且具有强而明确信号的肿瘤细胞核。排除小而规则、不规则或有歧义的荧光假象。若至少20%的评估肿瘤细胞核呈现明确的断裂模式（分离的绿色和橙色信号），则该病例被定义为ETV6::NTRK3重排阳性。

**结果**

**临床发现**

4例儿童ORTI患者的临床特征汇总于表1。研究队列全部为男性婴儿（4/4，100%），发病年龄范围为0.5至10个月（平均：3.9个月；中位数：2.5个月）。所有4例患者（100%）均以血尿为首发症状。肿瘤侧别分布均匀，2例发生于左肾，2例发生于右肾。影像学评估显示，所有4例均表现为实性肾脏肿块（图1），其中3例（75%）检测到明显钙化。肿瘤大小范围为2.5至4.0cm（平均：3.15cm；中位数：3.05cm）。

表1 本文报告的ORTI临床特征

| 编号 | 年龄（月） | 性别 | 临床表现 | 侧别 | 大小（cm） | 影像 | 治疗 | 随访（年） |
|------|-----------|------|----------|------|-----------|------|------|-----------|
| 1 | 0.5 | M | 血尿 | L | 2.5 | 实性肿块 | 肾切除 | 2 |
| 2 | 2 | M | 血尿 | R | 3 | 伴钙化的实性肿块 | 肾切除 | 15 |
| 3 | 10 | M | 血尿 | L | 4 | 伴钙化的实性肿块 | 肾切除 | 1（失访） |
| 4 | 4 | M | 血尿 | R | 3.1 | 伴钙化的实性肿块 | 肾切除 | 10 |

失访表示失访。

图1 A，非对比轴位磁共振成像显示左肾不规则肿块。B，对比增强轴位图像显示不规则轻中度强化。C，对比增强矢状位图像显示肿块边界不清，与肾实质分界不良。

所有4例患者均接受根治性肾切除术作为主要手术干预，未给予新辅助或辅助治疗。3例患者有临床随访数据，随访时间为2至15年（中位数：10年）。末次随访时，所有3例患者均存活，无局部复发或远处转移证据。其中1例患者（病例3）术后1年无症状，随后失访（表1）。

组织学上，所有肿瘤均表现出特征性的双相形态模式，主要由成骨的类骨质区域和高细胞梭形细胞区域组成，通常在周围压迫残存的一小条邻近正常肾组织（图2A）。类骨质区域与高细胞梭形细胞区域之间的界限通常不明显且界定不清，呈现逐渐的形态学过渡。此外，这些过渡区域和高细胞区域经常表现出继发性退行性变，包括局灶性出血和不同程度的坏死（图2B、C）。

图2 A，病理组织学显示肿瘤主要由类骨质（O）和梭形细胞（S）区域组成。周围可见少量残余肾组织。B、C，类骨质细胞区域与梭形细胞区域之间的边界不清，并有局灶性出血和坏死改变。D，在类骨质细胞表面可观察到覆盖其上的成骨细胞。

形态学上，成骨成分由不规则的编织骨和类骨质基质组成，其表面明显环绕着一层活跃的成骨细胞（图2D）。此外，在病例4中，在这些富含成骨细胞的区域内明确鉴定到局部粗钙化（图3D）。

图3 A，梭形细胞区域细胞排列密集，混有芽状组织样细胞。B、C，在病例2和3中，部分梭形细胞排列呈分叶状模式，伴有局部小血管扩张和出血。D，在病例4中，成骨细胞所在区域可见局部钙化。

梭形细胞成分细胞密度高，由密集排列、交叉的温和梭形细胞组成，偶尔混有原始的芽状组织样细胞簇（图3A）。值得注意的是，在病例2和3中，部分梭形细胞增生呈明显的分叶状生长模式排列。这种分叶状结构常伴有显著的间质血管网络，特征性表现为局部薄壁小血管扩张及相关的背景出血（图3B、C）。

**免疫组织化学和FISH**

4例儿童ORTI病例的免疫组织化学特征汇总于表2。免疫组织化学染色显示，所有4例病例（100%）在类成骨细胞和梭形细胞两种成分中均呈现异常的核和胞质β-catenin阳性（图4A-D）。所有病例中类成骨细胞成分的核染色均为弥漫性（4/4），梭形细胞成分为弥漫性（n=3）或局灶性（n=1）。

下游Wnt通路的激活进一步得到Cyclin D1的支持，Cyclin D1在两种成分中均显示局灶性核阳性（图5F；在所有梭形细胞区域为局灶性，在类成骨细胞区域则表现不一[1例弥漫性、1例局灶性、2例阴性]）。

表2 ORTI的免疫组化谱

案例 | ALK | β-catenin | Cyclin D1 | Ki-67 | P53 | SATB2 | SMA | WT1 | Pan-TRK | CD34 | S100
1 | 类成骨细胞: ? + ? 15% +（F）+ ? + ? ? ? | 梭形细胞: ? ++（F）30% +（F）++（F）+ ? ? ?
2 | 类成骨细胞: ? ++ 5% +（F）+ ? + ? ? ? | 梭形细胞: ? ++（F）20% +（F）+ ? + ? ? ?
3 | 类成骨细胞: ? + ? 5% +（F）+ ? + ? ? ? | 梭形细胞: ? +（F）+（F）10% +（F）++（F）+ ? ? ?
4 | 类成骨细胞: ? ++（F）2% +（F）+ ? + ? ? ? | 梭形细胞: ? ++（F）5% +（F）+（F）? + ? ? ?

F表示局灶性。

图4 A、B、C、D 在所有4例中，β-catenin的免疫组化染色在类成骨细胞区域和梭形细胞区域均显示核阳性。

图5 A Ki-67在梭形细胞区域的表达高于骨样组织区域。B WT1在两个区域均有表达。C PAX8在残余肾小管中阳性。D、E SMA和Pan-TRK均为阴性。F Cyclin D1在梭形细胞区域和骨样组织区域均显示局灶性核阳性。

两种成分均显示WT1（4/4）（图5B）和SATB2（类成骨细胞4/4弥漫性；梭形细胞中3例弥漫性和1例局灶性）的强弥漫性核免疫反应性。PAX8在所有病例的肿瘤细胞中均为阴性，而强核染色则突出了非肿瘤性的残余肾小管背景（图5C）。肿瘤细胞对pan-TRK（0/4）（图5E）和SMA（类成骨细胞区域0/4；2例梭形细胞局灶性）（图5D）均为阴性，同时对ALK（0/4）、CD34（0/4）和S100（0/4）也均为阴性。Ki-67增殖指数显示了明显的生物学梯度，梭形细胞成分（5%至30%）一致高于骨样/类成骨细胞区域（2%至15%）（图5A）。所有肿瘤均表现出正常的野生型p53表达模式。

通过FISH检测，所有4例均未检出ETV6::NTRK3基因重排（0/4）（图6），与pan-TRK免疫染色的完全缺失相一致。

图6 所有病例中均未通过FISH检测到ETV6::NTRK3基因融合。A，1例；（B）2例；3例和4例的数据未提供。

NGS（全基因组测序和全外显子组测序）

对4例ORTI进行了NGS检测，包括1例全基因组测序（WGS）和3例全外显子组测序（WES），并设有配对正常组织对照。在所有4例中均检测到CTNNB1第3外显子中反复出现的体细胞激活热点突变CTNNB1 c.121A>G（p.Thr41Ala）。这种经典的驱动性改变与免疫组化观察到的异常核β-catenin表达一致。

除核心的CTNNB1驱动突变外，各病例的基因组谱存在差异。全基因组测序病例（1例）携带BRAF、AXIN1和AXIN2中意义不确定的体细胞变异（VUS）。2例携带APC的体细胞VUS，同时伴有BMPR1A中的常见种系多态性（p.Pro2Thr）。在3例中，CTNNB1 p.Thr41Ala突变是唯一具有致病性的体细胞改变。4例表现出CTNNB1热点突变，同时伴有涉及APC、AXIN2、PTEN和TP53的多个VUS和常见种系多态性；这些均未被归类为致病性驱动事件。

在经典肾细胞癌驱动基因中，包括VHL、MET、FH和错配修复基因，均未检测到反复出现的致病性体细胞改变。在该队列中未鉴定出有害的TP53体细胞突变。所有病例的关键分子病理特征的综合汇总见表3。

表3 ORTI的基因组特征

案例 | 方法 | 主要基因组特征
1 | 全基因组测序 | CTNNB1:NM_001904:exon3:c.A121G:p.T41A；BMPR2:NM_001204:exon12:c.G2811A:p.R937R；MET:NM_000245:exon2:c.C534T:p.S178S；BRAF:NM_001378470:exon2:c.T144G:p.Y48X；AXIN1:NM_003502:exon2:c.C238T:p.P80S；AXIN2:NM_001363813:exon4:c.G977T:p.R326L
2 | 全外显子组测序 | CTNNB1:NM_001904:exon3:c.A121G:p.T41A；BMPR1A:NM_004329:exon3:c.C4A:p.P2T；APC:NM_000038:exon10:c.G942T:p.M314I
3 | 全外显子组测序 | CTNNB1:NM_001904:exon3:c.A121G:p.T41A
4 | 全外显子组测序 | CTNNB1:NM_001904:exon3:c.A121G:p.T41A；APC:NM_000038:exon16:c.T5465A:p.V1822D；AXIN1:NM_003502:exon2:c.T762C:p.D254D；AXIN2:NM_004655:exon2:c.C148T:p.P50S；BMPR1A:NM_004329:exon3:c.C4A:p.P2T；PTEN:NM_001304717:exon2:c.C511G:p.L171V；TP53:NM_000546:exon4:c.C215G:p.P72R

基于GRCh38。WES表示全外显子组测序；WGS表示全基因组测序。

讨论

首先由Chatten等人于1980年描述的ORTI是一种极为罕见的儿童肾脏肿瘤，具有固有的良性生物学行为。近期综述表明，诊断时中位年龄约为4.3个月，超过80%的病例在出生后一年内被诊断，偶尔有病例通过常规产前超声检查在出生前被发现。2023年，单病例报告首次通过全外显子组测序在ORTI中鉴定了CTNNB1突变；然而，在较大队列中的全面分子特征化仍未被探索。在本研究中，我们扩展了这些初步发现，报道了迄今为止最大的具有长期临床随访（最长至10年）的分子特征化ORTI系列。利用全基因组测序和全外显子组测序，我们证明反复出现的第3外显子CTNNB1热点突变，伴随弥漫性核β-catenin蓄积，是这一罕见疾病的定义性特征性标志。

在组织形态学上，ORTI的特征是独特的双相结构，包括骨化成分和梭形细胞成分。骨化区域由骨样基质与突出的成骨细胞混合而成，常伴有钙化和矿物质沉积。梭形细胞区由致密的交织梭形细胞束组成；这些细胞短梭形，具有圆形规则的核，有丝分裂象罕见，位于血管化的基质中。值得注意的是，偶尔可观察到局部漩涡状排列混合芽细胞样细胞，整个肿瘤通常呈分叶状生长模式，并由厚纤维假包膜与相邻的正常肾实质分隔。历史上，这些多变的形态学特征曾导致与其他儿童肾脏肿瘤产生显著的诊断混淆，尤其是肾母细胞瘤和肾脏中胚叶性肿瘤。

在我们的队列中，免疫组化分析显示，类成骨细胞和梭形细胞成分均弥漫性阳性表达SATB2和WT1。梭形细胞还经常显示局灶性Cyclin D1表达，而p53呈野生型模式，pan-TRK则统一为阴性。关键是，我们发现100%的病例（4/4）中两种成分均表现出强弥漫性核β-catenin表达。此前，ORTI被认为缺乏特异性的免疫表型或分子标志物。我们的发现确立了核β-catenin蓄积作为一种稳健、可重复的诊断生物标志物，极大促进了日常手术病理实践中ORTI的客观识别。

Wnt/β-catenin通路在胚胎肾发育和肿瘤发生中起着基本作用。CTNNB1（编码β-catenin）的致病性改变驱动了一系列人类肿瘤，包括胰腺实性假乳头状肿瘤（SPN）、硬纤维瘤和一部分肾母细胞瘤（WT）。本研究中的高通量测序揭示，在所评估的所有肿瘤中，CTNNB1第3外显子中存在反复出现的体细胞激活性热点错义突变（c.A121G, p.T41A）。涉及第3外显子的突变破坏了糖原合酶激酶-3β（GSK3β）磷酸化位点，阻止β-catenin降解，导致其组成性核转位和下游Wnt通路激活。有趣的是，尽管CTNNB1第3外显子突变通常与各种成人肿瘤中的侵袭性生物学行为或不良预后相关，但携带这种特定驱动突变的ORTI患者表现出良好预后。本系列中的所有患者在完全手术切除后均实现长期无病生存，证实了在ORTI中，CTNNB1突变的致癌效应局限于良性表型。

染色体4的克隆性三体曾被认为ORTI的关键细胞遗传学特征，用于将其与钙化型肾母细胞瘤区分开来。本研究通过确立CTNNB1第3外显子（c.A121G, p.T41A）基因为主要分子驱动事件，进一步完善了这一概念。鉴定这一分子特征对于鉴别诊断尤为重要。ORTI的主要拟态病变是细胞性先天性中胚叶性肾母细胞瘤（CMN），两者在1岁以下婴儿中共享重叠的临床和病理特征。过去，病理学家通常通过确认ETV6::NTRK3基因融合缺失（或证明pan-TRK表达阴性）来排除CMN。此外，尽管ORTI表现出强弥漫性核WT1阳性，这一特征与肾母细胞瘤共有，但显著的骨样形成、弥漫性核β-catenin染色以及缺乏经典三相组织学模式的存在均可可靠地排除肾母细胞瘤。

此外，肾透明细胞肉瘤（CCSK）的梭形细胞和硬化变异型因重叠的形态学特征（包括温和梭形细胞增殖和硬化/骨样基质）而进入鉴别诊断范围。然而，CCSK可以通过弥漫强阳性Cyclin D1（与ORTI中仅限于梭形细胞的局灶/弱Cyclin D1表达相对比）、PAX8阳性以及膜β-catenin染色阴性来可靠区分。CCSK携带特征性YWHAE::FAM22A融合，且缺乏CTNNB1第3外显子热点突变。

值得注意的是，CTNNB1是部分肾母细胞瘤中公认的驱动基因，常与WT1突变共存。然而，肾母细胞瘤是一种在遗传和表观遗传上复杂的疾病，特征为显著的异质性，包括11p15印记缺失（IGF2/H19）、WTX失活以及ARID1A和BCOR等染色质重塑基因突变。相比之下，ORTI表现出更为统一和简单的分子谱，主要由CTNNB1热点改变驱动，而不具备肾母细胞瘤特征性的广泛表观遗传失调。

除主要的CTNNB1驱动突变外，我们的测序分析还鉴定了Wnt/β-catenin通路其他关键调控因子中的次要改变，包括APC基因（2例）和AXIN1/AXIN2基因（如AXIN2中的p.P50S和p.R326L）中的错义突变。Axin和APC蛋白是β-catenin降解复合体的关键支架组分；这些基因中的异常进一步突出了Wnt通路失调在ORTI中的核心作用。值得注意的是，其中2例还携带BMPR1A基因突变（p.P2T）。BMPR1A（编码骨形态发生蛋白受体1型，又称ALK3，位于10q23.2）是TGF-β/BMP超家族中的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，在胚胎发育过程中作为成骨和软骨发生的调控信号转导因子发挥作用。鉴于BMP和Wnt信号通路之间在决定细胞命运和基质矿化方面已确立的交互作用，CTNNB1激活与BMPR1A突变的共存提示功能性Wnt-BMP轴在驱动ORTI特有的骨化和梭形细胞表型中发挥作用，这不仅阐明了其发病机制，还具有诊断价值。

总之，我们报道了迄今最大规模的ORTI系列，通过整合临床病理、免疫组化和多组学生物信息学分析及长期临床随访进行了全面特征化。我们确立了ORTI是一种独特的CTNNB1驱动的儿童肾脏肿瘤，其特征为反复出现的第3外显子热点突变（p.T41A）和异常核β-catenin表达。识别这些特定的分子和免疫表型特征将有助于病理学家准确诊断这一罕见疾病，并将其与恶性儿童肾脏拟态病变区分开来。