中枢神经系统的病毒储存库与神经HIV：快速研究尸检项目的启示

《Current Opinion in HIV and AIDS》：Central nervous system reservoirs and neuroHIV: lessons from rapid research autopsy studies

　　## 审查目的
组织中的HIV-1（HIV）储存库，尤其是在中枢神经系统（CNS）中，由于难以获取保存良好的人体组织，因此研究较少。本综述旨在 highlighting 快速研究性尸检研究关于HIV在CNS中持续存在的见解，特别关注活细胞方法、脑髓样细胞（BMCs）/小胶质细胞作为细胞储存库，以及HIV潜伏期和神经炎症的机制。我们还讨论了关键的知识空白，并探讨了这些方法如何为针对CNS HIV储存库的策略提供信息。

## 最新发现
最近的快速研究性尸检研究表明，结合基于组织的检测方法、活体CNS细胞方法和先进的多组学技术来研究CNS中的HIV储存库、潜伏期、病毒-宿主相互作用和神经病理机制具有价值。脑髓样细胞（BMCs）/小胶质细胞似乎是主要的CNS储存库，在抑制性抗逆转录病毒治疗（ART）期间可以容纳可诱导的、具有复制能力的HIV，其潜伏期主要由表观遗传机制调控。持续的HIV转录与IFN-I信号激活和神经炎症有关，可能导致HIV相关神经认知障碍（HAND）中的突触功能障碍和神经元损伤。

## 总结
尽管接受了长期ART治疗，HIV仍在中枢神经系统中持续存在，BMCs/microglia成为HIV治愈策略的关键储存库和潜在靶点。中枢神经系统的T细胞、星形胶质细胞和周细胞作为真正储存库的作用仍有待确定。快速尸检计划使得基于组织的、活体细胞、系统发育和多组学的方法能够共同解析CNS中HIV持续存在的复杂性。新兴证据进一步将表观遗传调控的HIV潜伏期和持续的IFN-I信号与HIV储存库的维持和中枢神经系统损伤联系起来。未来，将活体细胞和空间方法与纵向临床数据结合起来对于明确储存库之间的相互作用并开发消除CNS中HIV的策略至关重要。

## 关键点
- 即使在抑制性ART治疗下，HIV仍持续存在于中枢神经系统中，HIV DNA和RNA可在多个脑区被检测到，并且存在区域异质性。
- 脑髓样细胞，尤其是小胶质细胞，是主要的HIV功能性储存库，它们能够容纳在ART期间大部分处于转录沉默状态的可诱导、具有复制能力的病毒。
- CNS中的HIV储存库在生物学上是独特的且分区的，BMCs/microglia相关的病毒具有脑特异性、趋化巨噬细胞的特征；中枢神经系统的T细胞、星形胶质细胞和周细胞的作用仍不明确。
- 小胶质细胞中的HIV潜伏期受到表观遗传机制的强烈调控，包括组蛋白去乙酰化、去电荷化和DNA/组蛋白甲基化，这为针对中枢神经系统的潜伏期逆转和治愈策略提供了潜在靶点。
- 持续的病毒表达和炎症信号，特别是IFN-I，可能将CNS储存库与神经炎症和神经元损伤联系起来，从而导致HIV相关神经认知障碍（HAND），突显了整合活体细胞、空间、多组学和纵向临床方法的必要性。

### 引言
HIV-1（HIV）感染中枢神经系统（CNS），并在临床并发症（如HIV相关神经认知障碍（HAND）中起重要作用。尽管接受了抑制性抗逆转录病毒治疗（ART），HIV DNA和RNA在HIV感染者（PWH）的中枢神经系统中仍然普遍存在[1–5]，这表明中枢神经系统中存在持续的HIV感染。这些观察结果得到了PWH和猴免疫缺陷病毒（SIV）感染的非人灵长类动物（NHPs）中枢神经系统中病毒区室化复制的支持[3,6–9]。这些发现共同表明，中枢神经系统是一个重要的HIV储存库。因此，如果病毒在中枢神经系统的这种独特区域中持续存在，仅专注于清除外周系统中的HIV储存库的方法将无法实现HIV的治愈。本综述旨在综合快速研究性尸检研究中关于HIV在中枢神经系统中持续存在的细胞和分子机制的新兴见解。之前的综述，包括Dave等人的最新综述[10??]，已经全面总结了支持中枢神经系统作为HIV储存库的尸检证据。在这里，我们重点讨论了中枢神经系统HIV持续存在的关键知识空白，并探讨了快速研究性尸检方法在研究活体中枢神经系统细胞方面提供的独特机会，以及这些方法如何填补这些空白。我们介绍了活体脑髓样细胞（BMCs）/小胶质细胞和中枢神经系统T细胞的分离与特征分析的进展，支持它们作为主要HIV储存库的证据，以及调控这些群体中HIV潜伏期的机制。我们还讨论了快速研究性尸检和活体细胞方法在推进中枢神经系统储存库生物学研究以及为HIV治愈策略和预防中枢神经系统疾病提供信息方面的方法和局限性。最后，我们探讨了持续存在的HIV表达、I型干扰素（IFN-I）信号、慢性神经炎症和神经病理机制之间的新兴关联。

###潜在的中枢神经系统储存库和关键知识空白
识别所有细胞储存库是消除中枢神经系统中的HIV的第一步。一个真正的细胞储存库必须在有效的ART治疗下支持HIV的持续存在数月、数年甚至数十年，并保持产生感染性病毒的能力，并在ART中断后促进HIV潜伏期的逆转和病毒反弹[11]。图1概述了基于当前研究的潜在HIV中枢神经系统储存库，包括BMCs/microglia[12–14]、中枢神经系统T细胞[15,16??,17??,18]，以及可能的星形胶质细胞[19–23]和周细胞[24]。下面总结了这些潜在的中枢神经系统储存库以及我们对中枢神经系统HIV持续存在理解的关键知识空白。

### 中枢神经系统T细胞是否是重要的储存库？
静息的CD4+ T细胞是已知的外周组织中的HIV储存库[11]，可能有助于HIV最初进入中枢神经系统。HIV感染会消耗CD4+ T细胞并降低CD4+/CD8+ T细胞比例，而ART可以抑制脑内的病毒载量并部分恢复免疫细胞群[18]。仅在T细胞中的转基因小鼠研究表明，人类T细胞可以迁移到大脑，建立中枢神经系统感染，并在ART作用下维持病毒持续存在[18]。然而，中枢神经系统CD4+ T细胞是否形成一个稳定的、可诱导的潜伏HIV储存库尚不清楚。CD4+ T细胞在大脑实质中很少见，它们占据特定的生态位。在小鼠中，大脑驻留的CD4+ T细胞在室管膜下器官中富集，并表现出升高的IFN-γ、IL-17和CXR6表达[25??]。与这种有限分布一致，健康的成年小鼠和人脑中仅含有约2000个CD4+ T细胞，其中包括约150个调节性T细胞，这支持了跨物种存在一种保守的大脑驻留CD4+ T细胞群体的观点[26]。
相比之下，脑脊液（CSF）中含有更多的T细胞，主要是CD45RO+记忆T细胞，CD4+/CD8+比例约为4:1，负责中枢神经系统的免疫监视[27,28]。转录活跃的HIV感染CD4+ T细胞克隆可以通过CSF传播并通过克隆扩增持续存在[15]。因此，与主要存在于大脑实质中的髓样储存库不同，中枢神经系统CD4+ T细胞主要位于CSF、脑膜和血管周围空间[16??]。然而，它们对长期HIV持续存在的贡献仍不确定。在Last Gift队列中，每克脑组织平均回收了4585个CD3+ T细胞和158,068个BMCs/microglia[29]。值得注意的是，在接受ART治疗的参与者中，在BMCs/microglia中检测到了可诱导的、具有复制能力的HIV，而在中枢神经系统CD3+ T细胞中未检测到HIV储存库[29]，这表明中枢神经系统CD4+ T细胞在长期病毒持续存在中的作用可能不如BMCs/microglia显著。

### 髓样储存库（小胶质细胞/巨噬细胞）是否是主要的中枢神经系统HIV储存库？如果是，它们的关键特征是什么？
血管周围的巨噬细胞和小胶质细胞已被确定为大脑中的主要长期储存库。在这些中枢神经系统细胞群体中检测到了前病毒DNA以及HIV RNA和蛋白质[2,4,5,21]。在转基因小鼠模型中直接证明了髓样细胞中的持续HIV感染，其中只有髓样细胞（没有T细胞）作为潜伏HIV的储存库。在ART中断后，病毒血症从中枢神经系统重新进入外周血液[14,30,31]。如上所述，可以从PWH和NHPs的大脑中分离出髓样细胞。这些BMCs不含T细胞，包含95.9–99.9%的TMEM119+小胶质细胞。重要的是，从接受长期ART抑制的PWH或NHPs中纯化的BMCs/microglia中可以回收具有复制能力的HIV[1,6,29,32]，强烈支持BMCs/microglia是所研究供体中主要的中枢神经系统HIV储存库的观点。
尽管有这些证据，我们对BMCs作为HIV储存库的理解仍然有限，特别是因为研究的供体数量较少、中枢神经系统内的区域异质性以及与活细胞回收相关的技术挑战。现有研究表明，BMCs，尤其是小胶质细胞，在抑制性ART治疗期间可以容纳持续存在的、可诱导的HIV。小胶质细胞是长寿的、自我更新的细胞，主要存在于大脑实质中，并且相对抵抗HIV诱导的细胞凋亡[15,32,33??,34]。小胶质细胞中的HIV持续存在也可能受到表观遗传机制和特定髓系谱系转录程序的影响[15,28,34]。这些特征对储存库的持续存在和治疗靶点具有重要意义。它们的长寿和自我更新能力可能促进HIV感染细胞的长期持续存在，而它们对细胞凋亡效应的抵抗力和独特的表观遗传和转录程序可能有助于HIV持续存在的稳定性和调控。然而，这些特征在体内直接促进HIV储存库的建立和维持的程度仍有待确定。

### 星形胶质细胞和周细胞能否作为真正的中枢神经系统HIV储存库？
与BMCs/microglia类似，星形胶质细胞也表现出潜在的HIV储存库特征。它们占所有胶质细胞的20–40%，寿命长，可以自我更新，支持长期病毒持续存在[33??,34]。星形胶质细胞广泛分布在中枢神经系统中，包括大脑实质、血管周围区域和大脑表面，使它们能够直接与进入中枢神经系统的HIV或HIV感染细胞相互作用。在PWH的大脑中，多达19%的星形胶质细胞中检测到了HIV DNA，这与HAND的严重程度相关[21,23]。尽管传统上认为星形胶质细胞由于缺乏HIV受体CD4+而不适合病毒入侵，但新兴证据表明，星形胶质细胞可能通过非CD4+依赖的替代感染机制（包括细胞间传播和受体介导的内吞作用）获得HIV[35–46]。感染的星形胶质细胞含有整合的HIV DNA并表达病毒蛋白和炎症介质，可能促进HAND的发病机制[23,47–50]。然而，星形胶质细胞是否构成真正的中枢神经系统HIV储存库仍存在争议。要将星形胶质细胞确定为真正的储存库，需要从接受ART抑制的PWH中分离出高度纯化的星形胶质细胞，严格排除污染的髓样细胞和T细胞，然后证明整合的HIV DNA、可诱导的HIV转录，理想情况下还能回收具有复制能力的病毒。这类研究将提供确定星形胶质细胞是否能够在体内建立和维持稳定HIV储存库所需的功能证据。
关于周细胞也提出了类似的问题。最近的体外研究表明，初级周细胞可以被HIV感染[23]；然而，支持它们作为HIV储存库的体内证据仍然有限。应用相同的标准——包括严格的纯化、确认整合的HIV DNA、可诱导的病毒表达以及证明具有复制能力的病毒——对于确定周细胞是否为真正的中枢神经系统HIV储存库至关重要。

### 中枢神经系统HIV持续存在中的其他未解决的问题
除了关于中枢神经系统细胞储存库的知识空白外，还有几个关键问题尚未得到解答（见表1）。一个关键问题是，中枢神经系统HIV储存库是否直接导致ART中断后的全身病毒反弹。尽管中枢神经系统在解剖学上与外周循环系统分离，但病毒可能在两者之间转运，中枢神经系统储存库的重新激活可能会促进HIV重新侵入外周感染。定义ART中断期间中枢神经系统与外周系统之间的病毒交换的程度和方向性对于理解病毒反弹动态和确定是否需要针对性地针对中枢神经系统储存库以实现持久缓解或治愈至关重要。另一方面，目前尚不清楚是否存在类似在部分PWH中观察到的精英控制器表型的中枢神经系统控制器表型，他们在没有ART的情况下能够维持外周病毒的抑制。

### 表1：理解中枢神经系统储存库的关键知识空白
| 储存库类型 | 知识空白 |
| --- | --- |
| T细胞储存库 |
- 中枢神经系统T细胞是否是重要的病毒储存库？如果是，其规模和分布如何？
- 中枢神经系统T细胞储存库主要位于哪里——在CSF、脑膜、血管周围空间还是大脑实质中？
- T细胞储存库如何与BMCs和/或星形胶质细胞相互作用以支持中枢神经系统内的HIV持续存在？ |

### BMC/microglia储存库
- 不同脑区的BMC储存库规模如何？在不同参与者中如何？
- BMC中的HIV主要是转录活跃的还是沉默的？
- 哪些表观遗传调节因子和/或转录因子控制BMC中的HIV转录和潜伏期？
- BMC是否天然抵抗HIV介导的细胞凋亡？如果确实如此，如何克服这种阻力以消除中枢神经系统（CNS）中的HIV储存库？星形胶质细胞：星形胶质细胞是否构成了真正的CNS储存库？如果是这样，感染和潜伏的机制是什么？其他CNS细胞：其他CNS细胞类型，如周细胞甚至少突胶质细胞，是否也作为HIV储存库？其他主题：关键问题：CNS隔室：包括脑实质、血管周围空间、脑膜、脑脊液（CSF）和脊髓在内的不同CNS解剖隔室是否承载生物学上不同的HIV储存库，这些特定隔室的储存库如何促进HIV的持续存在？病毒反弹：在停止抗逆转录病毒治疗（ART）后，HIV是否会从大脑扩散到外周？是否存在CNS HIV控制型表型？HIV治愈：什么策略可以根除CNS储存库？“踢和杀灭”（Kick and Kill）、深度沉默等方法。免疫激活：在ART抑制期间，慢性神经炎症是如何产生和持续的？神经元损伤：在抑制性ART治疗期间，导致神经元损伤的主要因素是什么？另一个重要的考虑点是，CNS不是一个统一的解剖隔室，HIV的持续存在可能在脑实质、血管周围空间、脑膜、脑脊液和脊髓中存在显著差异。这些隔室在细胞组成、免疫环境、ART渗透性以及与外周血液循环的相互作用方面有所不同，这些都可能影响HIV储存库的持续存在。这种区别对于CNS T细胞尤为重要，因为脑脊液、脑膜、血管周围空间和脑实质中的T细胞可能代表具有不同HIV持续存在和病毒反弹贡献的生物学上不同的群体。同样，脊髓也是一个重要的但相对较少研究的CNS隔室，它可能独立于或与大脑储存库一起携带HIV。最后，关于在长期抑制性ART治疗期间如何维持慢性免疫激活，以及持续的HIV感染和炎症信号如何导致神经元损伤和HIV相关神经疾病（HAND）的发病机制，仍有几个重要问题尚未解答。目前还不清楚低水平的病毒转录、残留的病毒蛋白和缺陷的病毒体如何通过先天免疫途径在系统性病毒抑制的情况下维持CNS炎症。CNS驻留细胞（包括小胶质细胞、星形胶质细胞和CNS相关T细胞）相对于外周免疫细胞和其他炎症刺激的相对贡献也尚未明确。需要进一步的研究来确定持续的免疫激活如何影响神经元功能、突触完整性、胶质细胞稳态和血脑屏障功能，以及这些影响是否可以通过抑制残留的HIV表达来逆转。定义这些机制对于确定治疗靶点以预防或逆转接受长期ART治疗的PWH患者的HAND至关重要。

快速研究自体解剖：整合组织研究和可存活细胞水平研究以解决中枢神经系统HIV储存库的关键缺口：互补的基于自体解剖的资源，包括国家神经艾滋病组织联盟（NNTC），提供了大量的固定和冷冻的CNS组织、神经病理学以及临床/神经认知表型数据[10??]，而快速研究自体解剖项目（如Last Gift队列）则能够实现短时间内的死后采样和可存活细胞功能研究。接下来我们将讨论Last Gift队列[51–53,54??]如何为解决上述关于CNS HIV储存库的关键知识缺口提供新的机会。这个由NIH资助的项目招募患有终末期疾病的PWH患者，进行HIV治愈研究，并在死亡后约6小时内进行纵向的临床、神经学、神经心理学、病毒学、血液和脑脊液评估以及快速研究自体解剖。这种短时间的死后间隔使得能够收集高质量的组织，保持核酸完整性和细胞活力，以便进行细胞学、分子学、组织学、病毒生长和体外功能研究。该项目采样超过40个解剖部位，包括16个CNS区域和脑脊液，为定义CNS HIV持续存在的分子景观并将组织发现与生前病毒学和临床结果联系起来提供了独特的机会。图2总结了使用Last Gift脑组织研究CNS HIV储存库的互补方法，将传统的基于组织的检测方法与可存活细胞方法和先进的多重组学分析相结合。基于组织的检测方法（如ddPCR和IPDA）可以检测到HIV DNA，但无法确定HIV的细胞类型特异性和真正的复制能力。先进的方法——包括RNAscope、单核多重组学、空间转录组学和空间蛋白质组学——可以在细胞和空间分辨率上绘制病毒-宿主相互作用图谱，但需要高质量的组织。然而，这些方法都无法明确确定病毒复制能力，而这是定义CNS中真正HIV储存库的金标准。Last Gift快速研究自体解剖项目及其合作伙伴最近成功开发了从新鲜人脑组织中分离出组织驻留免疫细胞（包括可存活的CNS细胞）的方法[29]。这些可存活细胞方法使得能够全面表征细胞HIV储存库，包括脑T细胞、BMCs/小胶质细胞和可能的星形胶质细胞。通过整合基于组织的检测方法、ddPCR和空间检测方法，这些互补方法有助于研究CNS细胞HIV潜伏的机制和功能，评估CNS定向HIV治愈策略，并研究这些储存库对病毒持续存在、病毒反弹和免疫激活的贡献。此外，将这些发现与纵向临床和神经影像数据联系起来，可能进一步阐明CNS储存库特征与疾病结果之间的关系。下面，我们将总结通过该队列收集的脑组织的研究结果，并讨论如何通过整合传统的基于组织的、可存活细胞和先进的多重组学方法来加深我们对CNS HIV储存库的理解。

从Last Gift脑组织研究中获得的见解，以推进我们对中枢神经系统HIV储存库的理解：对六个Last Gift参与者进行的初步分析显示，基于HIV DNA定量和跨组织隔室的序列比较分析，HIV在多个组织部位（包括大脑）中持续存在[55]。随后对Last Gift快速解剖项目中额外12名PWH的研究进一步证实了即使在长期病毒抑制的情况下，HIV DNA和RNA也存在于多个组织和五个脑区[17??]，尽管这些测量结果没有与认知表现相关联[17??]。我们最近的sc/snRN-seq分析也捕获了接受ART治疗的PWH患者的CNS中的低水平HIV RNA[56??]。这些发现共同证实了在抑制性ART治疗期间HIV在CNS中的持续存在，结果表明无论检测到的病毒DNA是否具有复制能力，都可以使用IPDA在CNS髓系细胞中检测到完整和缺陷的病毒体[10,57,58,59–61??]。为了进一步定义CNS细胞储存库，我们的团队开发了一种从Last Gift队列中快速收集的脑组织中顺序分离可存活CD3+ T细胞和CD11b+ BMCs的协议。简而言之，在从UCSD送到UNC HIV治愈中心的24小时内处理组织以分离CNS细胞。然后通过两步协议将脑组织片段立即分离成CNS单细胞悬浮液。通过抗CD3抗体珠子选择CNS T细胞用于CNS T细胞储存库分析。接着，通过选择CD11b+细胞从CD3- NHL细胞中纯化BMCs/小胶质细胞[29]。未来的研究可以从CD3?CD11b?部分中分离其他CNS细胞类型，如星形胶质细胞、周细胞和少突胶质细胞（图2）。我们对四个PWH组织（三个来自Last Gift队列，一个来自NDRI）的初步研究表明，可以从快速研究自体解剖后的脑组织中成功分离出可存活的BMCs和CD3+ T细胞，这些细胞可以在体外培养和维持1–2个月，具体取决于PWH的年龄和组织质量。高度纯化的BMCs在大约两周内附着在培养容器上[29]，随后可用于机制研究，包括HIV潜伏逆转、检测复制能力的HIV以及评估BMCs定向的HIV治愈策略。因此，Last Gift项目提供的高质量快速自体解剖以及分离不同CNS细胞群体的既定方法，使得可以将组织水平的研究与可存活细胞检测方法相结合。这使我们能够对多个分辨率水平上的CNS HIV储存库进行全面表征，从而加深对HIV储存库及相关CNS细胞生物学的理解。

在 Last Gift 脑组织研究中获得的见解，以推进我们对中枢神经系统 HIV 储藏库的理解：首次对六个 Last Gift 参与者的 CNS 中 HIV 持续存在的分析显示，基于 HIV DNA 定量和跨组织隔室的序列比较分析，HIV 在多个组织部位（包括大脑）中持续存在[55]。随后对 Last Gift 快速解剖项目中加入的另外 12 名 PWH 的研究进一步证实，即使在长期病毒抑制的情况下，HIV DNA 和 RNA 也存在于多个组织和五个脑区[17??]，尽管这些测量结果没有与认知表现相关联[17??]。我们最近的 sc/snRN-seq 分析也捕获了接受 ART 治疗的 PWH 患者的 CNS 中的低水平 HIV RNA [56??]。这些发现共同证实了在抑制性 ART 治疗期间 HIV 在 CNS 中的持续存在，结果表明使用 IPDA 可以在 CNS 髓系细胞中检测到完整和缺陷的病毒体[10,57,58,59–61??]。为了进一步定义 CNS 细胞储存库，我们的团队开发了一种从 Last Gift 队列中快速收集的脑组织中顺序分离可存活 CD3+ T 细胞和 CD11b+ BMCs 的协议。简而言之，组织在从 UCSD 运送到 UNC HIV Cure Center 后 24 小时内被处理以分离 CNS 细胞。然后通过两步协议将脑组织片段立即分离成 CNS 单细胞悬浮液。接着使用抗 CD3 抗体珠子选择 CNS T 细胞用于 CNS T 细胞储存库分析。随后通过选择 CD11b+ 细胞从 CD3- NHL 细胞中纯化 BMCs/小胶质细胞[29]。未来的研究可以从 CD3?CD11b? 部分中分离其他 CNS 细胞类型，如星形胶质细胞、周细胞和少突胶质细胞（图 2）。我们对四个 PWH 组织（三个来自 Last Gift 队列，一个来自 NDRI）的初步研究表明，可以从快速研究自体解剖后的脑组织中成功分离出可存活的 BMCs 和 CD3+ T 细胞，这些细胞可以根据 PWH 的年龄和组织质量在体外培养和维持 1–2 个月。高度纯化的 BMCs 在大约两周内附着在培养容器上[29]，随后可用于机制研究，包括 HIV 潜伏逆转、检测复制能力的 HIV 以及评估 BMCs 定向的 HIV 治愈策略。因此，Last Gift 项目提供的高质量快速自体解剖以及分离不同 CNS 细胞群体的既定方法，使得可以将组织水平的研究与可存活细胞检测方法相结合。这使我们能够对 CNS HIV 储藏库进行全面下游表征，以多种分辨率水平深入理解 HIV 储藏库及其相关的 CNS 细胞生物学。

在 HIV/AIDS 被发现后不久，主要通过免疫染色和原位杂交方法识别出携带 HIV 的脑细胞类型。在病毒血症活跃的个体中，许多研究表明，髓系谱系的细胞（包括小胶质细胞和血管周围巨噬细胞）在 CNS 中表达 HIV RNA 和蛋白质[62,63]。最近，类似的方法也被应用于病毒被抑制的 PWH 的脑组织。Ko 等人[4] 应用了 DNAscope 原位杂交结合细胞类型特异性免疫染色来在单细胞分辨率下定位 HIV DNA。他们发现可检测到的 HIV DNA 主要位于 CNS 髓系细胞中，包括小胶质细胞和血管周围巨噬细胞。在两项研究中进一步检查了细胞类型分配[21,23]。Cochrane 等人[59] 将 DNAscope 与 CD68 免疫荧光和激光捕获的 CD68+ 髓系细胞微解剖结合，确认了病毒被抑制的供体中 BMCs 中存在 HIV DNA。Jamal Eddine 等人[64] 然后在 CD68+ 髓系细胞中主要发现了 HIV p24 (Gag)，但在 p24+ CD3+ T 细胞中很少发现，这些细胞局限于血管周围或血管内隔室。这些发现共同表明 BMCs 是 CNS 中的细胞 HIV 储藏库。然而，这些检测方法无法确定检测到的 HIV 是否具有复制能力，以及是否代表真正的 CNS 储藏库。在来自 Last Gift 队列的两名接受抑制性 ART 治疗的 PWH 和来自 NDRI 和 Last Gift 队列的分别在中断 ART 18 天和 7 天后的两名 PWH 的 BMCs 中，都可以检测到 HIV DNA 和 RNA，平均每 10^6 个 BMCs/microglia 中有 1769 个 HIV DNA 株，范围从 40 到 4950 个拷贝/10^6 microglia，平均 HIV 整合 DNA 水平为 415 个拷贝/10^6 个细胞。整合和总病毒 DNA 水平分别比病毒 RNA 高 7.92 倍和 33.13 倍[29]，这表明即使在某些供体中短期中断 ART 治疗后，大多数 BMC/microglia 中的 HIV 也是转录沉默的。值得注意的是，BMCs/microglia 中的 HIV RNA 水平与接受 ART 抑制的供体的外周 CD4+ T 细胞中的 HIV RNA 水平相当[65]，进一步支持了 BMCs/microglia 中的潜伏性 HIV 感染。

潜伏逆转研究表明，分离出的 CNS 髓系细胞/microglia 中的 HIV 病毒体主要受表观遗传机制控制：先前的体外研究表明，表观遗传调节因子（包括 CTIP2、Nurr1 和 C/EBP-β）通过不同的但重叠的机制促进 microglia 中的 HIV/SIV 潜伏。CTIP2 与 HIV/SIV LTR 内的 Sp1 位点结合，并招募 HDAC1/2 和 SUV39H1，促进 Nuc-1 脱乙酰化和 H3K9me3 在 HIV 启动子周围的沉积[66]。Nurr1 招募 CoREST 复合体（包括 HDAC1/2、G9a 和 EZH2）来建立抑制性染色质[67]，并促进 microglia 中的 HIV 潜伏。同样，C/EBP-β 亚型通过限制局部组蛋白乙酰化和减少 Tat 和宿主延伸因子对 HIV LTR 的招募来抑制病毒转录[68]。总体而言，这些发现表明减少的组蛋白乙酰化和增加的抑制性组蛋白甲基化有助于体外 microglia 中的 HIV 潜伏。几项研究还展示了髓系和 T 细胞储存库之间在 HIV 表观遗传调控方面的显著差异。HIV 感染的巨噬细胞表现出异常的 H3K9me3/H3K27ac 双价染色质特征和病毒基因组上的 DNA 羟甲基化（5hmC）增加[69]。虽然长链非编码 RNA (lncRNA) HEAL 通过招募 p300 并增加 H3K27ac 沉积来促进 HIV 转录[70]，但 BRD4 激动剂和表观遗传调节因子 ZL0580 通过限制 Tat 的招募和减少 HIV LTR 的抑制性染色质来抑制病毒转录[71]。这些发现共同表明，这些复杂的、细胞类型特异性的表观遗传机制调节了 microglia 中的 HIV 持续存在。然而，这些观察结果需要在直接从接受 ART 抑制的 PWH 中分离出的 BMCs/microglia 中进行验证，类似于在接受 ART 的个体中研究的静止 CD4+ T 细胞中的 HIV 潜伏。为此，我们使用从接受抑制性 ART 的四名 PWH 和接受 ART 抑制的 SIVmac251/239 感染的 NHP 中分离出的 BMCs 进行了体外潜伏逆转研究。我们发现，包括 HDAC 抑制剂 SAHA 在内的表观遗传调节因子有效逆转了 BMCs/microglia 中的 HIV/SIV 潜伏。SAHA 一致诱导了 microglia 中游离病毒 RNA 的释放。双重组蛋白和 DNA 甲基化抑制剂 CM272 也诱导了 HIV 转录，并进一步增强了 SAHA 介导的潜伏逆转 1.74 倍[29]。重要的是，SAHA 和 CM272 的组合在所有四名 PWH 的 BMCs/microglia 中诱导了病毒生长，同时检测到 HIV RNA 和 p24，从而提供了 CNS 内可诱导病毒储存库的证据。相比之下，NF-κB激动剂ingenol衍生物PEP005作为CD4+ T细胞中最有效的潜伏期逆转剂（LRAs）之一，在BMCs/小胶质细胞中的活性有限。从一位接受ART治疗的参与者的BMCs中逆转潜伏期的病毒具有高度的复制能力，并成功感染了从HIV阴性供体中分离出的T细胞和原代小胶质细胞[29]。同时，我们分析了从相同组织中分离出的CNS CD3+ T细胞，但没有检测到病毒增殖现象。这可能反映了CNS T细胞库的缺失，或者与更为丰富的BMCs/小胶质细胞相比，分离出的CNS T细胞数量相对较少，从而限制了增殖检测的敏感性[29]。在后续的研究中，我们发现一种选择性的组蛋白脱酰基酶抑制剂（HDCRi）——citarinostat，能够有效逆转来自接受ART治疗的PWH和接受治疗控制的NHPs的BMCs/小胶质细胞中的潜伏期SIV/HIV感染。值得注意的是，HDCR抑制在逆转潜伏期方面的效果比HDAC抑制更强，表明组蛋白脱酰基化在BMCs/小胶质细胞中的HIV潜伏期中起着关键作用[72??]。有趣的是，已知为HIV超延长复合体（SEC）/P-TEFb通路组分的crotonylation读取蛋白ENL，反而抑制了HIV转录，并起到了促进潜伏期的作用。从机制上讲，ENL招募deubiquitinase USP7来稳定BRD4，从而加强了HIV的潜伏期。相反，使用选择性PROTACs抑制或靶向降解ENL或USP7，可以有效逆转来自接受ART治疗的PWH的原代小胶质细胞中的潜伏期HIV[73??]。目前尚不清楚哪些SEC相关蛋白被 crotonylated或 acetylated以促进ENL在HIV启动子处的转录抑制。

总而言之，这些发现确定了表观遗传调控是BMCs/小胶质细胞中HIV潜伏期的关键机制，并且是一个潜在的治疗靶点。表观遗传LRAs，包括SAHA和citarinostat，可以在离体条件下增强BMCs中的HIV转录，但它们是否能在体内诱导HIV转录尚待研究。未来，有效的CNS治愈策略需要在最小化神经炎症和神经元损伤的同时，确保药物在CNS各部分充分暴露。将穿透CNS的LRAs与基于免疫的方法（如广谱中和抗体或CAR T细胞疗法）结合起来，可能会在清除病毒库的同时限制CNS毒性。

关于HIV在脑内的基因组分析，目前对CNS中HIV序列的理解主要基于组织水平的研究。通过不同队列（NNTC和Last Gift队列）的脑组织研究，多个团队[55,61,74]证明了HIV在CNS和周围组织之间的分区以及HIV的持续存在，并有证据表明不同解剖区室之间的病毒交换有限。我们最初的HIV测序研究[29]显示，来自BMCs的病毒与脑组织中的proviral序列更为相似，而不是与PBMCs或淋巴组织的病毒序列相似，这支持了HIV的真实CNS起源。从表型上看，来自BMCs和小胶质细胞的病毒具有巨噬细胞趋向性，而同一供体的PBMCs中分离出的病毒及PBMCs衍生的provirus则具有T细胞趋向性。这些发现表明BMCs/小胶质细胞是PWH中的真实病毒库，其控制机制可能与T细胞库不同，突显了活细胞方法在解决HIV病毒库方面的价值，超越了组织水平分析。有趣的是，CSF研究[75,76]发现了与同期血浆病毒基因组成分不同的HIV群体，这与局部CNS进化一致，这些CSF变体表现出巨噬细胞趋向性或T细胞趋向性表型。综合这些发现，表明脑实质组织和CSF可能代表不同的但相互连接的CNS区室，T细胞库主要存在于CSF中，而BMC库主要位于脑实质内[15,16??]，并且可能携带具有不同趋向性和病毒库特征的HIV proviruses。

**快速研究解剖和活细胞方法研究中枢神经系统HIV病毒库的局限性和未来方向**
Last Gift和其他快速研究解剖项目的研究显著提高了我们对CNS HIV病毒库的理解。然而，这些方法也存在重要的局限性，包括死后间隔时间和组织质量的变异性、供体间的差异、生命末期的共病和系统性疾病、药物暴露以及脑区采样差异。活细胞分离工作劳动密集且可能获得的数量有限，而离体培养可能会引入细胞伪影。此外，核酸降解和有限的检测灵敏度可能会影响罕见HIV感染细胞的检测和特征描述。在解读快速研究解剖的研究结果和评估其在供体及CNS各部分之间的普遍性时，应考虑这些因素。主要的研究教训、发现和挑战总结在表2中。未来，将基于组织的测量与活细胞分离、功能病毒库检测、病毒测序和先进的组学方法相结合，对于进一步定义CNS HIV病毒库及其对病毒持续存在、 rebound和神经病理的作用至关重要。跨队列的标准化处理、测定平台、临床和神经认知测量、元数据收集和报告实践将有助于更稳健的跨研究比较，并帮助识别可重复的CNS HIV病毒库模式。

**表2：通过Last Gift快速研究解剖项目推进对CNS HIV病毒库理解的关键教训、主要发现和局限性**
**关键教训**
HIV在CNS中广泛但异质性地持续存在。
HIV DNA和RNA在多个脑区域均可检测到，支持CNS作为一个独立的病毒区室。病毒分布具有异质性，可能存在区域差异和局部热点，需要进一步研究。
BMCs，特别是小胶质细胞，是主要且功能上独特的CNS HIV病毒库。
可以从新鲜脑组织中分离出BMCs/小胶质细胞并维持其体外培养状态。它们含有大量的总HIV DNA和整合HIV DNA，但HIV RNA相对较低，表明在ART治疗下主要处于潜伏期感染状态。表观遗传潜伏期逆转剂可以诱导HIV转录并产生具有复制能力的病毒，提供了可诱导病毒库的功能证据。
CNS T细胞、星形胶质细胞和周细胞
星形胶质细胞、周细胞或CNS T细胞是否为潜在的病毒库仍有待确定。
CNS HIV病毒库在基因和表型上是分区的。
来自BMCs的HIV与脑组织中的病毒群体更为相似，并表现出巨噬细胞趋向性，支持BMCs作为一个独特的CNS病毒库。CSF可能代表另一个相互连接的CNS区室，具有不同的病毒群体和趋向性。
活细胞方法提供了超出基于组织检测的功能性见解。

**主要局限性和未来方向**
**组织与供体变异性**
死后间隔时间、组织质量、脑区、供体特征、生命末期共病、系统性疾病和药物暴露的差异可能会影响细胞活力、HIV检测和CNS免疫状态。
**技术和方法学局限性**
活细胞分离劳动密集、细胞产量有限、离体培养伪影、核酸降解和检测灵敏度可能限制罕见HIV感染细胞的检测和功能表征。
**跨研究异质性**
组织处理、测定平台、临床和神经认知测量、元数据和报告实践的差异可能会限制跨队列比较和发现的普遍性。

**新机遇：病毒-宿主相互作用、持续I型干扰素信号传导以及抗逆转录病毒治疗抑制期间中枢神经系统中的神经元损伤**
RNA组学方法，包括批量RNA测序（RNA-seq）、单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq/snRNA-seq）以及空间转录组学，正在逐渐揭示HIV感染脑的细胞和分子特征。对PWH脑组织的研究发现了在抑制性ART治疗期间持续的干扰素刺激、炎症和细胞应激信号[79]。Schlachetzki等人[80]从Last Gift供体的新鲜前额叶皮质组织中分离出小胶质细胞并进行了scRNA-seq和scATAC-seq分析。在三名参与者中的两名小胶质细胞中检测到了HIV DNA和RNA，其中约0.5%的小胶质细胞被感染。HIV RNA+的小胶质细胞表现出丰富的干扰素刺激和促炎转录特征，表明尽管经过抑制性ART治疗，受感染的小胶质细胞仍保持转录活性。与这些发现一致的是，在ART抑制期间，除了病毒RNA和DNA外还检测到了残留的病毒产物[77]。Henderson等人[77]在PWH的CSF中检测到了生物活性的HIV Tat，而我们最近的肽组学分析在即使在接受ART抑制的PWH患者的CSF样本中也发现了HIV衍生的肽，包括Env衍生的和Pol衍生的肽[78??]。HIV Gag表达也在ART抑制期间的脑组织中的CD68+髓系细胞和CD3+ T细胞中被检测到[65]。总的来说，这些发现表明尽管ART治疗有效，HIV在CNS中仍以RNA和蛋白质形式持续存在，并可能通过多种机制（包括神经炎症、神经元功能破坏和直接的细胞毒性）导致神经元损伤[85??]。然而，将残留病毒蛋白表达与神经元损伤联系起来的确切机制仍有待明确。

与持续的HIV感染和脑内病毒表达一致的是，越来越多的证据表明持续存在的I型干扰素（IFN-I）信号传导可能是CNS HIV持续存在与慢性神经炎症之间的潜在联系[79]。Borjabad等人[80]的早期报告表明，对HIV感染个体大脑进行的全基因组转录组分析发现了一组大约100个在处理过和未处理个体中都同样失调的基因，这些基因参与适应性免疫反应、IFN信号传导、细胞周期调节和髓鞘相关通路。最近，我们使用蛋白质组学分析在National NeuroAIDS Tissue Consortium (NNTC)的神经认知受损参与者中发现了增加的IFN-I信号传导[81??]。随后对Last Gift队列中两名病毒被抑制的参与者的scRNA-seq分析显示，多个CNS细胞群体中持续存在IFN-I信号，尤其是在星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞中，表明HIV持续存在与神经炎症有关，可能参与了HAND的发病机制[82??]。Kilroy等人[82??]报告称，缺陷HIV proviruses通过MDA5依赖的方式在髓系细胞中诱导IFN-I通路，从而导致慢性炎症。Byrnes等人[57??]还证明，在病毒被抑制的PWH患者的前额叶皮质中，星形胶质细胞和髓系细胞中增加了IFN-I信号诱导的Mx1和TNF的表达。值得注意的是，Mx1+髓系细胞的频率与病毒被抑制的参与者中总的、完整的和5′-缺陷的HIV proviral DNA相关，表明病毒负担与局部免疫激活有关。Kong等人使用脑类器官模型报告称，HIV感染的小胶质细胞表现出CCL2和CXCL10表达增加，以及多种IFN-I刺激基因（ISGs）的激活[81??]。这些炎症特征也扩展到了未感染的基质细胞、脉络丛细胞、神经前体细胞和旁观者神经元细胞，并伴随着神经递质转运蛋白表达的减少和细胞衰老及细胞死亡的增加[81??]。

除了在抑制性ART治疗期间持续的HIV表达外，内源性逆转录病毒的激活也可能进一步促进慢性炎症[81??]。此外，Nissen等人[83??]报告称，TNF在海马前体细胞中诱导了强烈的IFN-I反应，促进了趋化因子介导的和CXCR3依赖的T细胞招募，从而抑制了海马神经发生。

**除了IFN-I激活外，脑组学研究（包括基因组学、转录组学、表观基因组学和蛋白质组学）还揭示了ART抑制期间的细胞激活和持续的脑损伤[84??】。Yang等人[85??]使用单核多组学测序映射了13名健康个体和20名接受ART治疗的HIV感染个体死后脑的转录组和表观基因组景观。他们的分析显示，在多种细胞类型中存在广泛的和持续的HIV相关转录和表观基因组改变。星形胶质细胞和小胶质细胞都表现出持续的代谢压力、脂质积累和低水平的炎症信号，表明这些细胞未能在ART治疗下恢复正常静息状态。

综上所述，这些研究强调了一个共同的主题：尽管ART有效抑制了系统病毒，CNS仍维持着一个免疫学上独特的区室，在其中HIV感染的BMCs/小胶质细胞和其他CNS细胞类型持续存在IFN-I信号传导（见表3）。这种持续的神经炎症反应可能是由残留的HIV RNA表达、潜伏的人类内源性逆转录病毒的激活以及其他炎症介质（如TNF）驱动的[57,80,81–83??]。重要的是，我们的蛋白质组学分析表明，即使在接受ART治疗的PWH患者中，与突触功能和位置相关的多达27种蛋白质在大脑中显著下调，可能破坏突触前和突触后信号传导并导致神经元损伤[81??]。这些发现支持了一种模型，即持续的低水平神经炎症（包括IFN-I信号传导）可能有助于突触功能障碍和神经元损伤。持续性的干扰素-I信号传导、中枢神经系统（CNS）免疫激活以及残留的病毒转录可能是HIV在中枢神经系统持续存在的后果，同时也是导致持续神经病理变化和病毒库维持的机制。表3显示，在抗逆转录病毒治疗（ART）抑制期间，持续的一型干扰素激活和神经元损伤的情况。

- **特征/维度** | **在有效ART抑制期间的状态** | **分子和细胞机制（组学见解）**
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| **主要干扰素谱** | 慢性一类干扰素（IFNα和IFNβ）升高 | 高达23.3%的HAND（HIV相关神经认知障碍）患者脑蛋白直接与一类干扰素通路相关 |
| **细胞来源** | 星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞 | 单细胞RNA测序显示星形胶质细胞和小胶质细胞中的ISG（干扰素刺激基因）信号最强 |
| **激活驱动因素** | HIV RNA和非病毒性因素 | 由病毒库中的低水平HIV转录以及HIV RNA/IFN诱导的人内源性逆转录病毒（HERV-W1 Env）驱动 |
| **表观遗传影响** | 染色质重连和3D染色质重构 | 慢性干扰素暴露会重构小胶质细胞的3D基因组结构，使染色质处于活跃状态 |

**功能悖论**：
- 干扰素-I参与了HIV的持续存在，但其也具有神经毒性，会损害突触。
- 活性的ISG信号会扩散到未感染的周围CNS细胞（包括神经元），从而减少神经递质转运蛋白并加速细胞衰老。

**临床表现**：
- HIV相关神经认知障碍（HAND）中，持续的干扰素-I诱导的神经炎症与突触-树突损伤有关，这可能在30-50%的病毒被抑制的HIV感染者中导致轻度认知缺陷。

然而，仅靠干扰素-I信号传导难以完全解释HAND的复杂发病机制；其他炎症途径也可能导致接受ART治疗的HIV感染者出现神经元损伤和神经认知障碍。需要进一步研究来确定神经炎症（包括干扰素-I信号传导）在HAND发病机制中的相对作用，并确定是否可以对该途径进行靶向治疗而不影响其基本的抗病毒功能。

**结论**：
尽管有有效的ART，稳定的中枢神经系统HIV病毒库仍然是实现HIV治愈的关键障碍。Last Gift和其他新兴的快速研究项目提供了罕见且独特的高质量人脑组织样本，使得多种互补方法能够用于研究中枢神经系统中的HIV病毒库和神经HIV。这些研究支持小胶质细胞作为重要的、具有复制能力的CNS病毒库，并揭示了不同CNS区域中的独特病毒和细胞特征。小胶质细胞病毒库表现出与传统CD4+ T细胞病毒库不同的特征，可能通过独特的转录网络和表观遗传机制维持其病毒库状态。它们对HIV引起的细胞毒性效应和免疫介导的细胞死亡的抵抗力可能进一步促进了病毒持续存在，为在中枢神经系统和外周系统中根除HIV带来了额外的挑战。除了小胶质细胞之外，目前尚不清楚其他CNS细胞类型（如CNS T细胞、星形胶质细胞和周细胞）是否也作为真正的HIV病毒库。如果确实如此，这些不同类型的细胞如何相互作用并促进HIV的持续存在及其在神经HIV发病机制中的作用仍然是未来研究的重要方向。此外，持续的HIV表达以及其他炎症信号可能维持干扰素-I激活和其他神经炎症途径，从而导致突触损伤、神经元损伤和神经认知障碍的发病。

**致谢**：
无。

**财务支持和赞助**：
本工作得到了R21MH128034、R01MH136852、R21AI167709、R01AI186609、R01MH139466–01A1以及UM1AI164567项目的支持。

**利益冲突**：
作者声明不存在任何竞争利益。

**参考文献和推荐阅读**：
在年度审查期间发表的特别有趣的论文被标记为：
- 特别值得关注的论文
- 出色的研究