瘤内微生物群通过代谢-表观遗传串扰塑造肿瘤免疫治疗响应：工程化细菌作为可编程活体治疗平台

《Experimental Hematology & Oncology》：Intratumoral microbiota in cancer immunotherapy: metabolic-epigenetic crosstalk and engineered bacterial therapeutics

瘤内微生物组（intratumoral microbiome）通过其代谢物调节宿主免疫微环境和表观遗传景观，对免疫治疗疗效产生关键影响。微生物来源代谢物如短链脂肪酸（SCFAs）、次级胆汁酸、三甲胺N-氧化物（TMAO）和色氨酸衍生物，通过DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰（histone modifications）和非编码RNA（ncRNAs）重编程宿主细胞表观遗传，从而塑造抗肿瘤免疫并驱动免疫激活或免疫抵抗。反过来，缺氧、酸性和营养匮乏的肿瘤微环境（TME）重塑微生物组成与代谢，形成进一步影响治疗结局的恶性循环。鉴于这些关键作用，靶向瘤内微生物群已成为一种有前景的策略。合成生物学进展使工程化细菌（engineered bacteria）作为可编程活体治疗药物得以开发。这些工程化菌株实现肿瘤特异性定植、可控药物释放和多模式功能，例如细胞因子分泌、免疫检查点阻断、STING通路（STING pathway）激活和代谢重编程。通过增强免疫检查点抑制剂（ICIs）疗效并与细胞治疗协同，工程化细菌治疗代表一种提高免疫治疗效率的极具前景的方法。尽管临床转化面临异质性、抗载体免疫和制造复杂性等挑战，该策略为精准癌症治疗提供了新范式。

引言（Introduction）
TME是包含肿瘤细胞、其他细胞、血管和细胞外基质的复杂生态系统。肿瘤相关微生物群逐渐被视为该微环境不可或缺的新组分。高通量测序、无菌动物模型、微生物核酸富集和严格质控使研究可靠表明，肿瘤相关微生物群落并非被动旁观者，而是通过宿主免疫系统互作影响癌症进展、预后及放疗、化疗、靶向治疗和ICIs响应。

历史视角（Historical perspectives on tumor-associated microbes）
从1886年观察到恶性组织中的微小球状体，到1902年分离Micrococcus novus并诱导肿瘤；1983年发现幽门螺杆菌，1991年将其与胃癌病因联系；2010年高通量测序推动低生物量瘤内微生物群研究；2020年Nejman等分析7种癌症1,526份样本，证明组织特异性瘤内微生物群及胞内定位；2022年报道真菌参与胃肠道和肺癌肿瘤发生。2022—2024年空间转录组和CLEM揭示瘤内细菌在免疫抑制TME中有组织分布。自然肿瘤相关细菌具有肿瘤归巢能力，但缺乏安全性、可控性和治疗效力；合成生物学遗传回路、诱导型启动子和表面展示技术推动工程化细菌作为可编程活体治疗药物。

不同肿瘤中微生物群的组成与异质性（Composition and heterogeneity of microbiota across different tumors）
瘤内微生物群具有显著肿瘤类型特异性，主要位于免疫细胞和肿瘤细胞内。免疫细胞内微生物改变细胞因子谱和抗原呈递；肿瘤细胞内微生物影响增殖、凋亡和化疗敏感性。共同模式包括Pseudomonadota、Bacillota、Bacteroidota和Actinobacteriota常占主导；Fusobacterium、Streptococcus和Pseudomonas常富集于胃肠道和呼吸道肿瘤；多样性一般与预后相关但方向因癌种而异。肝细胞癌中Propionibacterium和Pseudomonas为肿瘤特异性；结直肠癌中F. nucleatum经FadA侵入肿瘤细胞，诱导自噬、灭活化疗药和干扰细胞周期；ETBF产生BFT激活Wnt/β-catenin；pks⁺ E. coli产生colibactin导致DNA双链断裂。乳腺癌中Staphylococcus、Lactobacillus和Streptococcus位于肿瘤细胞，乳酸介导组蛋白赖氨酸乳酰化。肺癌中L. iners与生存降低相关，R. mucilaginosa抑制NF-κB。PDAC以E. asburiae、K. pneumoniae和C. freundii为主；OSCC中Fusobacterium和Pseudomonas aeruginosa增加。

驱动肿瘤药物响应的关键参与者（Key participants driving tumor drug response）
瘤内微生物群驱动耐药。F. nucleatum通过促炎和免疫抑制TME、促进转移和DNA损伤及直接灭活化疗药介导CRC多药耐药；Lactobacillus经乳酸代谢重编程诱导宫颈癌放化疗耐受。肿瘤相关细菌诱导TAM表面TLR2/TLR4高表达，经MyD88和TRIF促进M2极化，上调IL-10、TGF-β和IL-13，抑制CD8⁺ T细胞并扩增Tregs。Enterobacter和Pseudomonas表达胞苷脱氨酶代谢吉西他滨。更深机制源于微生物代谢物对宿主的表观遗传重编程。

瘤内微生物群对免疫细胞的调控（Regulation of immune cells by the intratumoral microbiota）
益生菌及其代谢物激活免疫细胞、改善TME，增强ICI响应；TMAO经PERK增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫。病原菌促进免疫抑制和T细胞功能受损。F. nucleatum经FadA破坏E-cadherin/β-catenin复合物，β-catenin核转位上调ATG7、LC3B、Beclin-1，驱动自噬，并分泌IL-10、TGF-β，经PD-1/PD-L1促进CD8⁺ T细胞耗竭。

增强抗肿瘤免疫应答（Enhancing anti-tumor immune responses）
激活固有免疫通路（Activating innate immune pathways）：LPS、LTA、PGN和鞭毛蛋白作为PAMPs被PRRs识别，激活TLR-NF-κB，释放TNF-α，激活TAM和NK细胞，并促进CD8⁺ T细胞和Th1型CD4⁺ T细胞分化。微生物DNA经cGAS合成2′3′-cGAMP激活STING-TBK1-IRF3，产生IFN-α/β，促进DC成熟和交叉呈递。Bifidobacterium经cGAS-STING激活DC；A. muciniphila产生c-di-AMP刺激单核细胞分泌I型IFN。
促进效应细胞浸润和激活（Promoting effector cell infiltration and activation）：Lachnoclostridium与黑色素瘤CD8⁺ T细胞浸润正相关；E. rectale经Fos/Fosl信号促进NK细胞激活；H. hepaticus诱导Tfh并促进TLS成熟；分节丝状菌诱导Th17迁移至肿瘤并转为IFN-γ产生效应T细胞；A. muciniphila增加DC IL-12，增强PD-1疗效。

介导免疫抑制和耐受（Mediating immunosuppression and tolerance）
炎症驱动免疫抑制（Inflammation-driven immunosuppression）：ETBF分泌BFT上调SMO，增加ROS和氧化性DNA损伤；BFT经TLR4/NF-κB激活Th17；A. odontolyticus和P. anaerobius经TLR2/4诱导ROS。共生菌经γδ T细胞和MyD88依赖IL-1β/IL-23促进肺癌；F. nucleatum经TLR4/MyD88/NF-κB上调IL-6、IL-8、IL-17，激活STAT3/c-Myc并促M2极化。
抑制免疫细胞功能（Suppressing immune cell function）：F. nucleatum经Fap2结合TIGIT，上调PD-L1并损害CD8⁺ T细胞杀伤；胃癌中Methylobacterium与CD8⁺ TRM频率负相关。PDAC中微生物群经TLR驱动单核细胞向免疫抑制表型分化；LPS促PD-L1和IL-1β，扩增耐受性髓系细胞。清除瘤内微生物群可阻断TLR激活，降低PD-L1和IL-1β，增加M1巨噬细胞，激活CD8⁺ T细胞并改善抗PD-1响应。

瘤内微生物群来源代谢物与表观遗传重编程（Intratumoral microbiota-derived metabolites and epigenetic reprogramming）
微生物及代谢物通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和ncRNAs诱导长期重编程。SCFAs、次级胆汁酸、TMAO和色氨酸代谢物经HDAC抑制、FXR/TGR5激活、PERK调节和AhR信号影响免疫相关基因。TME缺氧、酸性和营养缺乏又重塑微生物组成和代谢，形成恶性循环。
抗肿瘤相关代谢物（Anti-tumor-associated metabolites）：SCFAs作为GPCR配体和天然HDAC抑制剂，丁酸抑制I类HDAC的IC₅₀为1.13 mM；SCFAs增强CTL和CAR-T活性。TNBC中TMAO经PERK诱导焦亡，增强CD8⁺ T细胞免疫。金黄色葡萄球菌β-毒素具抗血管生成潜力。放线菌次级代谢物具诱导凋亡和抑制增殖等抗肿瘤活性。
促肿瘤相关代谢物（Pro-tumor-associated metabolites）：甲酸经AhR信号促进CRC干细胞性、侵袭和转移；DCA和LCA为FXR天然配体，影响SIRT1、HDAC3和DNMTs；初级胆汁酸抑制线粒体呼吸，LCA经内质网应激损害T细胞功能。TMAO在CRC和HCC中促增殖、血管生成和免疫逃逸。色氨酸代谢物作为AhR配体调节表观遗传复合物，IDO活性预测抗PD-1抵抗。c-di-AMP激活STING并促IL-1β积累，作用具浓度和微环境依赖性。LPA经LPAR5调节CD8⁺ T细胞氧化代谢，促耗竭样分化。
表观遗传修饰酶和ncRNA网络（Regulation of epigenetic modifying enzymes and non-coding RNA networks）：ETBF经METTL14依赖m⁶A甲基化下调miR-149-3p，促进结肠炎和CRC。F. nucleatum经TLR4/MYD88下调miR-18a和miR-4802，激活保护性自噬；上调lncRNA ENO1-IT1促糖代谢；经EVADR和KRT7-AS促EMT和转移。
微生物群调控宿主表观遗传稳态（Microbiota regulation of host epigenetic homeostasis）：正常微生物群经DNA甲基化维持稳态，如Uhrf1维持Treg中Cdkn1a启动子甲基化。致病微生物诱导异常高甲基化，高Fusobacterium与UC中MINT2、MINT31、P16、NEUROG1高甲基化相关；CRC患者微生物群诱导PHLPP1高甲基化和转录下调。
免疫细胞的表观遗传调控（Epigenetic regulation of immune cells by intratumoral microbiota）：丁酸经HDAC抑制增强Foxp3启动子组蛋白H3乙酰化，促Treg分化；特定背景中丁酸经ID2增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤。

TME重塑瘤内微生物群组成和代谢状态（Tumor microenvironment remodels the composition and metabolic state of intratumoral microbiota）
缺氧驱动厌氧菌富集和代谢适应；酸性pH选择耐酸菌株如Lactobacillus和Enterococcus；营养剥夺迫使微生物上调嘌呤代谢、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成和核糖体生物发生；免疫抑制微环境选择可逃逸免疫清除的谱系。OSCC中细菌运动、趋化性和LPS合成基因在肿瘤组织中富集。

通过合成生物学工程化瘤内微生物群增强肿瘤治疗（Engineering intratumoral microbiota by synthetic biology to enhance tumor therapy）
肿瘤特异性定植和靶向递送（Tumor-specific colonization and targeted delivery）：缺氧/酸性响应启动子PfnrS、PnirB、PfdhF、Pvgb使治疗基因在肿瘤缺氧区表达；群体感应系统触发同步裂解和载荷释放；趋化工程过表达CheY或异源表达MCPs增强迁移；表面展示EGFR纳米抗体、BCMA亲和体、RGD肽、CTLA-4或PD-L1纳米抗体增强肿瘤富集。
多模式抗肿瘤策略（Engineered bacteria: multimodal anti-tumor strategies）：工程乳酸菌分泌IL-12、IL-15和TRAIL；EcN递送αPD-L1-PE38；工程菌产生2′3′-cGAMP或cGAMP联合CD47阻断；表达LOX或OMVs-EcL耗竭乳酸，重塑免疫抑制微环境。

临床转化进展和挑战（Clinical translation progress and challenges）
代表菌株包括VNP20009、Clostridium novyi-NT和EcN衍生物；ACTM-838进入I期。安全考虑包括减毒和生物防护（biocontainment），如axe/txe毒素-抗毒素系统。瓶颈包括质粒稳定性、瘤内进化风险、异质性定植、抗载体免疫、制造复杂性和监管不确定性。

前景（Prospects）
工程菌从单功能向智能多回路系统发展，多菌株合成共生体RCom可增强抗PD-1疗效并逆转耐药；与CAR-T、CAR-NK和FMT协同；个性化菌株设计依据患者肿瘤微生物组和免疫表型。

结论（Conclusion）
瘤内微生物组是TME公认标志，具癌种特异性和空间异质性，经代谢物驱动表观遗传重编程并双向调节抗肿瘤免疫。工程化细菌作为可编程活体治疗药物，通过肿瘤特异性定植、可控释放和多模式功能，有望成为精准癌症治疗的新一类活体药物。