U. ohnoi脂质提取物：化学表征、抗多重耐药菌活性与细胞毒性的抗菌新药研发探索

《Marine Biotechnology》：Lipid Extract from Ulva ohnoi Algae: Chemical Characterization, Antibacterial Potential, and Cytotoxicity in the Search for New Agents Against MDR Infections

　　

摘要

抗菌药物耐药性是一个关键的全球性问题。本研究探讨了Ulva ohnoi的脂质提取物（LE）对其他化学组成、抗菌活性以及对多重耐药（MDR）微生物的细胞毒性。该LE通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）、热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）进行表征。通过最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定其对多重耐药分离株的抗菌效力，这些分离株包括：鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）。研究人员使用MTT、中性红（NR）、乳酸脱氢酶（LDH）和溶血活性（HA）测定法，在小鼠成纤维细胞（L929）和牛肾成纤维细胞（MDBK）中评估了细胞毒性。脂质表征揭示主要成分为棕榈酸（63.62%）和油酸（21.01%）。TGA显示质量损失为88%，DSC显示无无定形/结晶区域。LE对金黄色葡萄球菌和CoNS（1.33 mg/mL）以及鲍曼不动杆菌和大肠杆菌（2 mg/mL）显示出良好的MIC值，表明其具有未分级粗提物典型的中等抗菌活性。MBC结果表明其具有抑菌活性（1–8 mg/mL）。该提取物在其MIC附近浓度（IC₅₀ 0.25–1.95 mg/mL）对L929和MDBK细胞具有细胞毒性，但血液细胞对其耐受性良好（HA IC₅₀ 4.705 mg/mL）。通过全面的化学表征和MDR分离株评估，U. ohnoi LE扩展了先前报道的Ulva脂质抗菌潜力，而非首次确立。然而，低选择性指数（SI < 10）表明该LE尚不具备足够的治疗窗口，这强调了进行生物测定指导纯化的必要性。尽管如此，它仍是开发新型抗菌药物的起点。

**Ulva ohnoi脂质提取物：化学表征、抗多重耐药菌活性与细胞毒性的抗菌新药研发探索**

**一、 研究背景与问题提出**

抗菌药物耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁。世界卫生组织（WHO）将多重耐药（MDR）细菌列为全球公共卫生面临的十大威胁之一，细菌耐药性的出现和传播严重削弱了现有抗生素（ATBs）的疗效，导致相关疾病发病率和死亡率不断攀升。因此，寻找结构新颖、作用机制独特的抗菌药物先导化合物迫在眉睫。大型绿藻作为一种生物活性物质的潜在来源，尤其是被称为“海莴苣”的石莼属（Ulva）藻类，因其丰富的生物多样性和可大规模培养的特性而备受关注。已有研究证实石莼属藻类富含长链多不饱和脂肪酸（PUFAs），并具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。

然而，针对Ulva ohnoi这一特定物种的研究，先前主要集中在硫酸化多糖组分上，而其脂质组分的生物学活性研究极为有限。仅有一项研究（Kang et al., 2021）报道了U. ohnoi油脂对非耐药参考菌株的定性抗菌活性，但该研究并未进行定量的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定，也未针对临床相关的MDR病原体进行评估，更未涉及哺乳动物细胞系的细胞毒性研究。鉴于脂肪酸（FA）丰富的脂质提取物（LE）被认为是具有独特膜活性抗菌机制、可能规避现有耐药机制的天然产物来源，系统评估U. ohnoi LE的化学组成、抗MDR菌活性及安全性，对于开发利用这一丰富生物资源具有重要意义。本研究旨在填补这一空白，首次采用标准化MIC/MBC方法，结合全面的化学表征和多种细胞毒性评估，系统研究U. ohnoi LE。

**二、 研究主要方法**

研究人员从巴西南圣弗朗西斯科杜苏尔州弗洛里亚诺波利斯的一个水产养殖设施中采集了U. ohnoi藻类生物质，并采用Bligh和Dyer方法进行脂质提取。研究使用气相色谱-质谱联用（GC–MS）对脂肪酸甲酯（FAMEs）进行化学表征，通过热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）评估其热稳定性。抗菌活性检测采用微量肉汤稀释法测定MIC和MBC，测试对象为来自巴西南里奥格兰德州佩洛塔斯市两家医院的多重耐药（MDR）临床分离株，包括革兰氏阴性菌鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌。细胞毒性评估使用了小鼠成纤维细胞（L929）和牛肾成纤维细胞（MDBK）两种细胞系，分别采用MTT、中性红（NR）、乳酸脱氢酶（LDH）和溶血活性（HA）四种独立测定法，并计算选择性指数（SI）。

**三、 研究结果**

**脂质提取物组成**：GC–MS分析显示，U. ohnoi LE中饱和脂肪酸（SFAs）占比最高（67.10%），其中棕榈酸（C16:0）为主要成分，占总相对面积的63.62%。单不饱和脂肪酸（MUFAs）占25.85%，主要是油酸（C18:1；21.01%）和棕榈油酸（C16:1；4.84%）。多不饱和脂肪酸（PUFAs）占7.05%，包括α-亚麻酸（C18:3；3.93%）、亚油酸（C18:2；1.77%）、十八碳四烯酸（C18:4；0.97%）和十六碳四烯酸（C16:4；0.37%）。

**热分析**：TGA显示LE在198 °C、334 °C、447 °C和477 °C发生四个主要热降解事件，累积质量损失约88%。DSC分析在-80 °C至300 °C范围内未检测到显著的玻璃化转变、结晶或熔融等热事件，表明该脂质提取物在测试条件下为无定形体系，无可测量的晶体区域。

**对MDR医院分离株的抗菌活性**：U. ohnoi LE对所有测试的MDR菌株均表现出抗菌活性。对金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的MIC值最低，为1.33 mg/mL；对鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的MIC值为2 mg/mL；对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的MIC值为4 mg/mL。所有测试浓度下（最高至8 mg/mL）均观察到细菌再生长，MBC值均>8.00 mg/mL，表明该提取物表现出抑菌作用。

**细胞活力评估**：溶血活性（HA）测定显示，仅在最高浓度8 mg/mL时观察到显著溶血，IC₅₀值为4.705 mg/mL，表明LE对红细胞具有良好的耐受性。MTT和NR测定结果显示，LE对两种细胞系均表现出浓度依赖性的细胞毒性，但敏感度因细胞系和测定方法而异。IC₅₀值范围在0.25至1.95 mg/mL之间。LDH测定表明，LE在各浓度下均可导致细胞膜损伤。溶剂对照（乙醇）实验证实，所用乙醇浓度对细胞活力无显著负面影响。

**选择性指数（SI）**：综合分析所有细胞毒性测定（MTT、NR、LDH）的IC₅₀和MIC值，计算得到的SI值均低于10，范围在0.41至1.37之间，表明LE的抗菌活性浓度接近或高于其细胞毒性浓度，目前尚不具备充分的安全治疗窗口。

**四、 讨论与结论**

本研究通过全面的化学表征和系统的生物学评估，证实了U. ohnoi LE的抗菌潜力主要归因于其丰富的脂肪酸组成，尤其是棕榈酸和油酸等。多步热降解特性和无定形状态为其加工、储存和制剂开发提供了关键参考数据。LE对MDR菌株表现出中等强度的抑菌活性，扩展了石莼属脂质的已知抗菌谱，但其低选择性指数和明显的色素干扰是当前应用的主要瓶颈。研究明确指出，该提取物的活性可能源于多种脂肪酸的协同或相加作用，而非单一成分。尽管LE在红细胞中表现出良好的耐受性，但在有核细胞中的细胞毒性限制了其作为全身性抗菌药物的直接应用。未来研究应聚焦于生物测定指导的分离纯化，以富集活性成分、阐明作用机制并提高治疗指数。此外，也可探索局部给药、伤口敷料或抗菌涂层等应用形式，从而发挥其作为新型抗菌药物先导来源的潜力。