鼠李糖脂与温和热处理对单核细胞增生李斯特菌的协同灭活效应：水分活度与pH的影响

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Combined effects of heat and rhamnolipids against Listeria monocytogenes: Influence of water activity and pH

　　

食源性疾病仍是主要的公共卫生问题，其中单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）因其高致死率及在食品加工环境中的持久性而成为最重要的食源性病原体之一。本研究在栅栏技术框架下，评估了热处理、pH和水分活度（aw）对鼠李糖脂（RL）抗单核细胞增生李斯特菌活性的联合效应。处理条件设定为62 °C持续10 min，在不同pH和经NaCl或蔗糖调节的水分活度（aw）条件下进行。增加NaCl浓度降低了单独热处理的效力；然而，其与RL的组合产生了协同效应，在含NaCl的低aw培养基中实现了超过5 log CFU/mL的减少。在含蔗糖的培养基中，联合处理在所有评估的pH和aw条件下将存活菌群减少了4–5 log CFU/mL。这些栅栏组合还显示出作为针对附着在不锈钢表面的单核细胞增生李斯特菌的消毒剂配方的潜力，同时扫描电子显微镜揭示了处理后细胞的广泛结构损伤。温和热处理与鼠李糖脂的组合在一系列pH和水分活度条件下表现出协同抗菌活性，代表了控制单核细胞增生李斯特菌的一种前瞻性策略，特别是在具有高盐或高糖含量的低水分活度食品中。

一、研究背景与目的

食源性疾病每年在全球范围内导致大量疾病和死亡，造成巨大经济损失。其中，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是尤为突出的食源性病原体，由其引起的李斯特菌病具有高住院率和死亡率。该病原体能够耐受广泛的pH、温度和水分活度（a_w）变化，并具备形成生物膜和在食品加工环境中持久存续的能力，这使其在整个食品供应链中难以根除。因此，如何在保障食品品质的同时有效控制单核细胞增生李斯特菌，是食品工业面临的重大挑战。

传统的强烈热处理虽能有效杀菌，但会损害食品的营养和感官品质。栅栏技术通过组合多种温和的抑菌或杀菌因子，旨在增强微生物灭活效果的同时降低单一处理的强度。鼠李糖脂（RL）是一种由假单胞菌属（Pseudomonas）产生的糖脂类生物表面活性剂，具有良好的表面活性、乳化性和抗菌特性。已有研究表明，环境条件如pH和溶质种类会影响RL的抗菌活性，例如酸性条件和NaCl的存在可增强其对单核细胞增生李斯特菌的作用。然而，关于RL与温和热处理在不同pH和a_w条件下的联合效应，特别是使用不同食品相关溶质（如NaCl和蔗糖）时的效果差异，以及该组合用于食品接触表面消毒的潜力，尚缺乏充分研究。

基于此，本研究旨在系统评估温和热处理、RL、pH及降低的a_w（分别由NaCl和蔗糖调节）对单核细胞增生李斯特菌ATCC 19112灭活的联合效应，并探究其在不锈钢表面消毒中的应用潜力。研究人员假设，这些栅栏因子的组合将比单一处理产生更强的灭活效果，从而为开发新型微生物控制策略提供依据。

二、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   水分活度（a_w）测定：使用LabStart-aw仪器在室温下测定不同NaCl和蔗糖浓度培养基的水分活度。
2. 2.
   联合处理实验：在特定pH（5.0、6.0、7.0）和a_w条件下，对单核细胞增生李斯特菌悬浮液分别进行单独热处理（62 °C，10 min）、单独RL处理（5000 mg/L）及两者联合处理，通过平板计数法计算对数减少因子（LRF），并根据Feyaerts等人的标准判断协同或相加效应。
3. 3.
   扫描电子显微镜（SEM）：观察经不同处理后细菌细胞的形态学变化。
4. 4.
   表面消毒试验：将单核细胞增生李斯特菌接种于不锈钢片（AISI 304）上，干燥后进行不同组合的处理（含或不含RL、NaCl），在不同时间点（1、5、10 min）测定存活菌数。

三、主要研究结果

1. 在NaCl存在下的联合处理效果

研究发现，增加NaCl浓度会降低单独热处理的效率，在a_w为0.90和0.87时尤为明显。相反，在酸性条件下，增加NaCl浓度增强了RL的抗菌活性，而在pH 7.0时RL活性始终有限。关键的发现是，热处理与RL的联合处理在所有测试条件下均表现出协同效应，其灭活效果超过了单独处理效应的理论总和。特别是在低a_w（如0.87）和酸性pH条件下，联合处理使活菌数减少了超过5 log CFU/mL。即使在无外加溶质的培养基（a_w 0.96）中，也观察到了协同作用。

2. 在蔗糖存在下的联合处理效果

使用蔗糖调节a_w时，RL在pH 5.0时活性最强，平均减少约1.5 log CFU/mL。但与NaCl不同，增加蔗糖浓度并未显著改变RL在同一pH下的活性。尽管如此，热处理与RL的联合处理在所有pH和a_w条件下仍表现出协同活性，使活菌数减少约4–5 log CFU/mL。值得注意的是，在pH 7.0且a_w为0.87的最不利条件下，虽然单个处理几乎无效，但联合处理却实现了约4 log的减少。

3. 扫描电子显微镜（SEM）观察

SEM图像显示，未经处理的细胞形态完整。单独RL处理导致细胞表面粗糙和轻微形态改变。单独热处理引起部分细胞塌陷和变形。而经过联合处理的细胞数量极少，且呈现出严重的形态损伤和聚集现象，表明细胞结构遭受了广泛破坏。

4. 表面消毒试验

在不锈钢表面消毒试验中，处理时间至关重要。当接触时间为10分钟或5分钟时，单独热处理、热处理联合RL以及热处理联合RL与NaCl的组合均能完全灭活单核细胞增生李斯特菌。然而，当接触时间缩短至1分钟时，所有处理均未能实现完全灭活，且未观察到明显的协同效应。这表明RL的抗菌活性需要足够的接触时间。

四、讨论与结论

讨论总结：

研究人员的讨论指出，热处理和RL的抗菌作用都主要靶向细胞质膜。温和热处理会增加膜的流动性和通透性，而RL作为两亲性分子也能插入并破坏膜结构。两者的协同效应很可能源于它们对同一细胞靶标的同步攻击。在低a_w条件下，由于分子流动性降低，细菌对热的抵抗力增强，但RL可能通过降低表面张力促进热传递或加剧热诱导的膜损伤。RL的自组装行为受温度影响，温度升高可能导致其超分子结构重排，从而增强与细菌膜的相互作用。

pH对RL活性的影响与其电离状态有关。在酸性条件下（低于RL的pKa值），RL分子主要以非离子形式存在，减少了与带负电细菌膜的静电排斥，从而更易嵌入膜中。NaCl通过静电屏蔽作用，能减少RL分子间的排斥力，促进其与膜的结合，这解释了为何NaCl比蔗糖更能增强RL活性。蔗糖主要通过偶极作用和氢键与RL相互作用，但其浓度在本研究的短时间处理（10分钟）内未显示出对RL活性的增强效应。

对于表面消毒试验，研究人员认为附着于表面的细胞可能与悬浮的浮游细胞行为不同，其微环境和与材料表面的化学相互作用影响了处理效果。此外，RL与细胞的接触时间不足可能是未观察到协同效应的原因。

研究结论翻译：

在评估的高溶质条件下，鼠李糖脂与温和热处理之间的协同相互作用凸显了这种基于栅栏的方法在控制单核细胞增生李斯特菌方面的潜力。此外，将鼠李糖脂与物理保藏方法相结合，可能代表了一种在食品工业中加强微生物控制的替代策略。