氧释放漱口水（O2MW）对伴放线聚集杆菌与中间普雷沃菌的种属依赖性抗菌、抗生物膜及基因表达效应：与0.12%氯己定的体外比较

《Clinical Oral Investigations》：An oxygen-releasing mouthwash shows species-dependent antibacterial and antibiofilm activity against periodontal pathogens

　　

目的：本研究在体外浮游和生物膜条件下，评估氧释放漱口水配方（O₂MW）是否对 Aggregatibacter actinomycetemcomitans 和 Prevotella intermedia 产生种属依赖性抗菌、抗生物膜及基因表达反应，并与0.12%氯己定（chlorhexidine, CHX）进行比较。

材料与方法：采用基于刃天青（resazurin）的肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），采用琼脂传代培养测定最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）。采用琼脂扩散法评估生长抑制。采用结晶紫染色定量生物膜生物量，采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）检查预形成生物膜结构和膜完整性。采用定量PCR（quantitative PCR, qPCR）评估黏附、毒素、氧化应激和铁相关基因。分子对接以过硼酸钠（sodium perborate）作为代表性氧释放成分。

结果：O₂MW 对 A. actinomycetemcomitans 的 MIC 为3.13%，对 P. intermedia 为50%。仅在 A. actinomycetemcomitans 中检测到 MBC。琼脂扩散显示，A. actinomycetemcomitans 从0.78% O₂MW 起出现抑菌圈，而 P. intermedia 仅在50%和100% O₂MW 时出现抑菌圈。O₂MW 降低生物膜生物量，最低生物膜抑制浓度（minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC）分别为1.56%和25%。CLSM 显示，较高浓度下生物膜生物量和厚度降低。亚MIC O₂MW 增加黏附和毒力相关基因表达，尤其是 A. actinomycetemcomitans 中的 ltxA，以及 P. intermedia 中的氧化应激和铁相关基因，包括 ahpF、ftnA 和 feoB。对接提示仅涉及通路水平。

结论：O₂MW 显示种属依赖性抗菌和抗生物膜活性，对 A. actinomycetemcomitans 在较低浓度下作用更强。研究结果支持在临床转化前进一步开展临床前和宿主细胞评估。

临床相关性：O₂MW 可能具有作为牙周生物膜控制辅助手段的潜力，但病原体特异性反应仍需进一步评估。

论文主体解读

一、研究背景与问题
牙周炎是一种菌群失调、生物膜驱动的炎性疾病，龈下微生物群落与宿主免疫反应相互作用，并促进牙周组织破坏。机械菌斑控制和牙周清创仍是治疗核心，化学辅助手段用于进入受限区域。氯己定（CHX）是参考口腔抗菌剂，具有广谱抗菌活性，但存在牙染色、味觉障碍、黏膜刺激以及重复或长期暴露相关顾虑。氧释放口腔护理配方受到关注，因为牙周袋和成熟口腔生物膜中存在低氧微环境，可支持厌氧牙周病原体。O₂MW 是一种含过硼酸钠（sodium perborate, SP）的氧释放漱口水配方，SP 是用于生物膜控制的口腔护理成分，可在水环境中介导过氧化物相关氧化活性。然而，不同牙周病原体对氧释放配方的反应可能不同，因为易感性受氧耐受、表面相关毒力因子、生物膜表型和氧化应激适应影响。A. actinomycetemcomitans 是兼性革兰阴性 pathobiont，毒力机制涉及黏附、免疫逃逸和毒素产生，包括白细胞毒素和细胞致死膨胀毒素。P. intermedia 是黑色素厌氧菌，与血红素获取、生物膜形成和氧化应激耐受相关。研究人员此前发现，O₂MW 可降低 P. gingivalis 生物膜形成并抑制部分黏附相关基因。因此，本研究比较 O₂MW 对 A. actinomycetemcomitans 和 P. intermedia 的抗菌和抗生物膜作用，以 CHX 作为参照，并评估选定的毒力、黏附、氧化应激和铁相关基因，同时对 SP 进行探索性分子对接。

关键技术方法概述：菌株 A. actinomycetemcomitans ATCC 29522 与 P. intermedia ATCC 25611 来源于 KWIK-STIK?（Microbiologics, St. Cloud, MN, USA）。O₂MW 为 Blue?m mouthwash（BlueM Europe, Zwolle, The Netherlands），CHX 由0.20% Parodontax? Extra（Omega Pharma Manufacturing GmbH, Herrenberg, Germany）稀释至0.12%。采用刃天青肉汤微量稀释法测定 MIC，琼脂传代培养测定 MBC，琼脂扩散评估抑菌圈，结晶紫染色定量生物膜生物量，CLSM 结合 LIVE/DEAD? BacLight? 评估预形成生物膜结构与膜完整性，qPCR 检测选定基因，以过硼酸钠为代表配体进行分子对接；统计使用 GraphPad Prism。

二、研究结果
1. 抗菌活性（Antibacterial activity）
通过基于刃天青的肉汤微量稀释法，研究人员发现 O₂MW 的抑制反应具有菌种特异性。A. actinomycetemcomitans 的 MIC 为3.13%，P. intermedia 的 MIC 为50%。MBC 仅在 A. actinomycetemcomitans 中检出，为3.13%；在测试浓度范围内，P. intermedia 未检出 MBC。通过体外琼脂扩散法，A. actinomycetemcomitans 在0.78%至6.25% O₂MW 下产生可测抑菌圈，从0.78%时的1.89±0.56 mm增加至6.25%时的4.51±0.87 mm；0.12% CHX 产生最大平均抑菌圈宽度，为10.58±0.79 mm。P. intermedia 在未处理对照及12.5%和25% O₂MW 下未见抑菌圈，仅在50%和100% O₂MW 下检测到抑菌圈，分别为2.36±0.08 mm和2.98±0.08 mm；CHX 产生相近抑菌圈，为2.78±0.15 mm。

2. 生物膜生物量抑制（Biofilm biomass inhibition）
通过结晶紫染色，研究人员发现 O₂MW 降低两种细菌的生物膜生物量。对于 A. actinomycetemcomitans，生物膜形成从0.39% O₂MW 开始降低，1.56% O₂MW 时降至未处理对照的22.15±3.30%，更高浓度下仍保持低水平；其 MBIC 为1.56%。对于 P. intermedia，O₂MW 以浓度相关方式降低生物膜形成，25% O₂MW 时降至42.01±7.20%；其 MBIC 为25%。0.12% CHX 也降低两种细菌的生物膜形成。

3. CLSM预形成生物膜分析（CLSM pre-formed biofilm analysis）
通过 CLSM 成像，研究人员观察到处理相关的生物膜结构和膜完整性染色变化。未处理的 A. actinomycetemcomitans 生物膜呈密集结构，以绿色荧光为主；CHX 处理组红/橙荧光增加、绿色信号减少。O₂MW 处理引起浓度相关绿色荧光减少和红/橙染色增加，在较高浓度尤其是6.25%时最明显。定量分析显示，未处理生物膜生物量最高，为24.47±2.88 μm³/μm²；O₂MW 和 CHX 均降低生物量。生物膜厚度随 O₂MW 浓度增加而降低，6.25%时最明显，为39.08±5.07 μm；CHX 也降低厚度。对于 P. intermedia，未处理生物膜同样呈密集绿色荧光，CHX 和 O₂MW 增加红/橙信号并减少绿色荧光，O₂MW 处理组中100%时红/橙模式最强。定量分析显示，未处理生物膜生物量最高，为33.80±6.04 μm³/μm²；O₂MW 和 CHX 将生物量降至11.56±2.68至23.02±5.41 μm³/μm²。厚度呈相似趋势，未处理生物膜为51.33±9.42 μm，O₂MW 处理组为23.58±3.80至38.17±5.36 μm。

4. qPCR分析（qPCR analysis）
通过 qPCR，研究人员评估了亚抑菌浓度 O₂MW 暴露后 A. actinomycetemcomitans 中 cdtA、ltxA、aae、emaA、omp100/apiA 和 omp64 的相对表达。30 min 时，0.78% O₂MW 增加所有检测基因表达，其中 ltxA 诱导最强；cdtA、aae、emaA、omp100/apiA 和 omp64 也升高。1.56% O₂MW 下，表达值总体低于0.78%，多数基因接近未处理对照范围，但 ltxA 仍升高。2 h 时，总体反应低于30 min，而 ltxA 在两个 O₂MW 处理组中仍高于对照。CHX 与 O₂MW 不同，降低 cdtA、aae、emaA 和 omp100/apiA 等基因表达，而 ltxA 高于未处理对照但低于0.78% O₂MW 组。对于 P. intermedia，30 min 时12.5% O₂MW 增加 ahpC、ftnA、feoB 和 ompA 等氧化应激、铁稳态和外膜相关基因，而 oxyR 低于未处理对照；25% O₂MW 组中若干基因表达低于12.5%，但 ftnA 仍升高。2 h 时，12.5% O₂MW 增加所有检测基因，25% O₂MW 呈基因依赖性表达，ahpF、ftnA 和 feoB 持续升高。CHX 与 O₂MW 不同，尤其 feoB 高表达，并增加部分氧化应激和铁稳态基因。

5. 对接分析（Docking analysis）
通过以过硼酸钠为代表性配体的探索性分子对接，研究人员评估其与选定蛋白靶点的潜在相互作用。对于 A. actinomycetemcomitans，平均对接分数范围为?3.83至?6.74 kcal/mol；Omp64 平均分数最负，为?6.74±0.03 kcal/mol，其后为 Aae、LtxA、CdtA、EmaA 和 Omp100。对于 P. intermedia，平均对接分数范围为?4.70至?6.71 kcal/mol；OxyR 平均对接分数最负，为?6.71±0.02 kcal/mol，其后为 FeoB、AhpF、OmpA、FtnA 和 AhpC。对接可视化显示过硼酸钠与选定蛋白靶点的预测相互作用，其中 A. actinomycetemcomitans 的 Omp64 和 P. intermedia 的 OxyR 具有最有利相互作用分数。研究人员强调，对接结果仅为探索性，提示通路水平参与。

三、讨论部分总结
研究人员指出，O₂MW 表现出差异性活性，A. actinomycetemcomitans 的 MIC 和 MBIC 低于 P. intermedia。琼脂扩散中，A. actinomycetemcomitans 在较低 O₂MW 浓度下出现抑菌圈，而 P. intermedia 需要更高浓度。尽管 CHX 产生比 O₂MW 更大的抑菌圈，但琼脂扩散并非单独衡量抗菌效力；抑菌圈还取决于溶解性、分子在琼脂中的扩散、从纸片释放动力学以及活性成分径向扩散中的稳定性。因此，O₂MW 较小的抑菌圈可能反映扩散受限或局部活性氧释放，而非内在抗菌活性较低。CHX 与 O₂MW 机制不同：CHX 是阳离子双胍类，结合细菌表面并破坏膜完整性；O₂MW 是氧释放配方。Fernandez y Mostajo 等报道了另一种氧合过硼酸钠系统 Ardox-X? 的不同选择性模式：最高 AX 浓度下，P. intermedia 抑菌圈为9±1 mm，A. actinomycetemcomitans 为2±1 mm；P. intermedia 的 MIC/MBC 低于 A. actinomycetemcomitans，分别为80/80 mg/L SP 与159/319 mg/L SP。本 O₂MW 配方则显示 A. actinomycetemcomitans 的 MIC 和 MBIC 更低。研究人员认为，这种差异可能反映配方特异性选择性、菌株背景、生长条件、暴露形式和生物膜模型，而非统一的过硼酸钠类效应。类似地，一种 hydro-carbon-oxo-borate 化合物在多物种龈下生物膜模型中显示抗生物膜活性，但 CHX 对包括 P. intermedia 在内的若干牙周物种产生更强降低。种属依赖性反应可能是多因素的，反映菌株特异性生理、生长需求、生物膜特征、配方依赖性暴露和氧化应激处理。另一种过硼酸钠系统的选择性对比提示，配方、实验背景和氧化应激反应也可能影响活性。过氧化氢（H₂O₂）已被证明在相对低浓度下抑制 A. actinomycetemcomitans，而 P. intermedia 中与血红素相关的色素可能有助于抵抗过氧化物。在本研究中，MBC 仅在 A. actinomycetemcomitans 中检出。对于 A. actinomycetemcomitans，生物膜生物量在测试浓度范围内降低，MBIC 为1.56%。由于该值低于浮游 MIC，O₂MW 的抗生物膜作用可能涉及干扰表面附着、定植或基质积累，而非仅抑制浮游生长；这与 Aae、EmaA 和 ApiA/Omp100 等表面相关黏附素在 A. actinomycetemcomitans 附着和生物膜形成中的作用一致。对于 P. intermedia，O₂MW 以浓度相关方式降低生物膜生物量，MBIC 为25%。虽然低于浮游 MIC，但显著高于 A. actinomycetemcomitans 的 MBIC，可能反映生物膜相关氧化应激耐受，包括血红素相关表面保护和铁(III)原卟啉IX色素形成，从而降低过氧化物易感性。由于结晶紫测量总附着生物量，包括细菌细胞和胞外基质，这些 MBIC 值应解释为生物膜积累减少，而非直接杀菌。临床上，针对 A. actinomycetemcomitans 的较低浓度体外作用可能具有相关性，因为该菌通过黏附和生物膜相关机制参与牙周定植，其致病性还与白细胞毒素和细胞致死膨胀毒素等主要毒力因子相关。亚 MIC 降低 A. actinomycetemcomitans 生物膜生物量可能提示限制表面定植或早期生物膜积累的潜在价值。然而，这些发现来自单种体外模型，不能确立临床疗效。P. intermedia 所需浓度更高，进一步提示 O₂MW 值得作为机械菌斑控制和生物膜破坏的潜在辅助手段进行评估，而非作为抑制成熟厌氧生物膜的独立策略。CLSM 分析显示预形成生物膜结构和膜完整性染色发生处理相关变化。在两种细菌中，O₂MW 均降低生物膜生物量和厚度，并增加红/橙荧光，较高浓度作用更强。这些发现提示 O₂MW 影响预形成生物膜的数量和结构。LIVE/DEAD 信号被解释为膜完整性终点，而不是细菌被清除或可培养性的证据。1 min CLSM 暴露反映临床漱口时长，而较长 qPCR 暴露为机制性而非临床模拟。研究人员此前 O₂MW 研究显示 P. gingivalis 生物膜形成减少，并抑制 fimA 和 hagA 表达；相比之下，本研究显示 A. actinomycetemcomitans 和 P. intermedia 的不同种属特异性反应，包括对 A. actinomycetemcomitans 更强的低浓度活性，以及两种菌在亚抑菌暴露下的应激相关转录反应。在 A. actinomycetemcomitans 中，0.78% O₂MW 增加 ltxA、cdtA、aae、emaA、omp100/apiA 和 omp64 表达，ltxA 反应最强。ltxA 转录增加不应解释为白细胞毒素产生或活性增加，因为本研究未评估该点；由于结晶紫和 CLSM 显示生物膜生物量和结构降低，这种增加也不应解释为生物膜活性增强，而可能反映低浓度 O₂MW 暴露后残余细胞的亚致死氧化应激反应。1.56% O₂MW 和2 h 时，多数基因表达较低，但 ltxA 仍升高。这与亚抑菌抗菌暴露可改变细菌基因表达、而更强暴露可能降低代谢活跃或反应细胞比例的报道一致。CHX 与 O₂MW 不同，降低若干定植相关基因，而 ltxA 转录仍呈应激反应。A. actinomycetemcomitans 的对接结果与表面定植参与一致，但仍为探索性；最有利预测分数涉及 Omp64、Aae 和 LtxA，这些与表面结构、黏附或毒力相关。结合 qPCR 数据，这些发现提示表面定植和毒力相关通路可能参与 A. actinomycetemcomitans 对 O₂MW 的反应。但对接不能证明过硼酸钠的直接结合、抑制或调控。在 P. intermedia 中，O₂MW 主要影响氧化应激和铁稳态基因。30 min 时，12.5% O₂MW 增加 ahpC、ahpF、ftnA、feoB 和 ompA，而 oxyR 未增加；2 h 时，12.5% O₂MW 增加所有选定基因，包括 oxyR，符合时间依赖性氧化还原应激反应。这是因为 OxyR 调控 P. intermedia 的氧化应激存活，OxyR 破坏影响氧和过氧化物应激下的存活以及 ahpC、ahpF 和 ftnA 等基因。ahpC 和 ahpF 增加提示过氧化物解毒活性，ftnA 和 feoB 增加提示铁储存和摄取参与。这一点重要，因为游离铁可促进自由基介导损伤，而铁蛋白样蛋白可通过限制可利用铁降低氧化应激。25% O₂MW 组反应不如12.5% O₂MW 广泛，但 ahpF、ftnA 和 feoB 仍升高，提示在更强亚抑菌暴露下过氧化物解毒和铁稳态通路仍活跃。因此，P. intermedia 需要更高 MIC 和 MBIC，可能反映其对 O₂MW 的直接易感性较低，以及存活细胞中氧化还原和铁保护通路的激活。CHX 在 P. intermedia 中产生更强的铁应激相关反应，尤其通过 feoB 和 ftnA 显著诱导，并观察到 ahpF 增加。这提示 CHX 和 O₂MW 均触发 P. intermedia 的应激相关转录变化，但 CHX 反应更以铁稳态和氧化应激相关基因为主导。P. intermedia 的对接发现支持这一解释，但仍为探索性；有利预测分数涉及 OxyR、FeoB、AhpF 和 OmpA，对应氧化应激、铁稳态和膜相关通路。然而，oxyR 诱导更可能反映氧化还原感应，而不是直接配体结合。因此，qPCR 和对接数据应解释为通路参与的支持性证据，而非直接分子靶点的证明。O₂MW 的作用还应考虑更广泛的口腔微生物组。氧合配方已显示对口腔链球菌的选择性作用，并改变多物种生物膜的组成和代谢；对早期定植菌的这种作用可能影响后续生物膜发展和生态演替。因此，未来研究应在多物种群落模型中检查 O₂MW。本研究存在局限。单种体外模型不能完全重现多物种牙周生物膜、唾液、宿主因素或龈下微环境。细菌接种物通过 OD₆₀₀ 标准化，因此等效 OD 值可能不代表两种细菌相同的活细胞密度。qPCR 数据仅代表转录反应，需要蛋白水平或功能验证。O₂MW 暴露后氧释放、过氧化物生成、活性氧、氧化还原变化和蛋白活性也未直接测量。未来研究还应确定此处鉴定的抗菌和抗生物膜浓度是否仍与宿主细胞活力和牙周组织修复兼容。尽管存在这些局限，O₂MW 显示种属特异性抗菌和抗生物膜作用，A. actinomycetemcomitans 的 MIC 和 MBIC 较低，而 P. intermedia 需要更高浓度。这些发现为进一步评估 O₂MW 用于牙周生物膜控制提供了临床前基础，而临床疗效仍有待确立。

研究结论翻译：总之，O₂MW 对 A. actinomycetemcomitans 和 P. intermedia 显示种属依赖性活性，对 A. actinomycetemcomitans 在较低浓度下作用更强。O₂MW 降低生物膜生物量和结构，并诱导黏附、毒力、氧化应激和铁稳态相关基因的独特转录反应。总体而言，这些发现支持进一步临床前评估 O₂MW 作为牙周生物膜控制的潜在辅助手段。