《Functional & Integrative Genomics》：Integrative transcriptomic analysis reveals tumor-adjacent mucosal remodeling in colorectal cancer
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肿瘤旁黏膜在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）转录组研究中常被用作正常对照，但其与远处正常黏膜及肿瘤组织之间的关系尚不明确。本研究对25例CRC患者的配对远处正常黏膜、癌旁黏膜和肿瘤组织进行了批量RNA测序（bulk RNA sequen
肿瘤旁黏膜在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）转录组研究中常被用作正常对照，但其与远处正常黏膜及肿瘤组织之间的关系尚不明确。本研究对25例CRC患者的配对远处正常黏膜、癌旁黏膜和肿瘤组织进行了批量RNA测序（bulk RNA sequencing），并利用这三种组织状态构建了有序的正常–癌旁–肿瘤（normal–adjacent–tumor, N-A-T）表达连续谱。尽管癌旁黏膜在整体上更接近远处正常黏膜，且两两比较分析未显示显著差异表达，但基于limma的线性趋势模型识别出沿N-A-T连续谱广泛存在的单调转录变化。朝向肿瘤方向的基因富集于翻译、RNA加工、细胞周期活性和增殖相关通路，而沿该轴表达下降的基因则与氧化代谢和上皮稳态相关。基于趋势基因的N-A-T评分在外部批量队列中将癌旁黏膜定位于正常组织和肿瘤组织之间，并与CRC中的增殖性和免疫低活性分子状态相关。单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）分析将该信号主要定位于上皮细胞，并将较高评分与增殖性和干性上皮状态相关联。综上所述，CRC癌旁黏膜并非完全等同于远处正常黏膜，而是携带着主要与上皮细胞程序相关的协调性肿瘤定向转录变化。
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一、研究背景与问题
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发生发展伴随着广泛的转录组重塑。RNA测序（RNA-seq）研究通过分子分型、通路分析和预后建模极大地增进了对CRC异质性的理解。然而，大多数转录组研究主要聚焦于肿瘤组织本身，对作为对照的正常参考组织的分子特征关注相对不足。这一问题在上皮源性肿瘤中尤为突出——肿瘤旁黏膜因在手术切除时易于获取，常被用作正常对照，但其与远处正常黏膜在分子层面是否真正等价，长期以来缺乏系统评估。
组织学上正常的肿瘤旁组织可能受到局部肿瘤微环境、炎症反应、代谢适应和上皮分子改变的影响，从而产生肿瘤相关的“场效应”（field effect）。如果癌旁黏膜在分子水平上与远处正常黏膜存在差异，那么将其作为参考组织可能影响肿瘤相关基因表达变化的解读。与此同时，这些差异也可能为肿瘤周围组织的早期转录改变提供有价值的信息。然而，在严格配对设计下对远处正常黏膜、癌旁黏膜和肿瘤组织三者进行系统比较的研究仍然有限。传统的两两差异表达分析能够识别离散组织组间的差异，但可能遗漏跨越有序组织状态的定向表达变化。因此，本研究旨在回答一个核心问题：癌旁黏膜在转录组水平上是否与远处正常黏膜等价，还是携带着与肿瘤相关的协调性表达变化。
二、研究内容与意义
针对上述问题，研究人员对25例CRC患者的配对远处正常黏膜、癌旁黏膜和肿瘤组织进行了批量RNA测序，共获得75个样本。利用这三种组织状态构建了有序的正常–癌旁–肿瘤（normal–adjacent–tumor, N-A-T）表达连续谱，并采用基于limma的线性趋势模型识别方向性表达变化。在此基础上开发了基于趋势基因的N-A-T评分，并在独立批量转录组队列和单细胞RNA测序数据中验证了其可重复性和细胞分布特征。
该研究的重要意义在于：首次在严格配对设计下系统刻画了CRC中三种组织状态的转录组关系，证明癌旁黏膜并非完全等同于远处正常黏膜，而是处于正常与肿瘤之间的中间转录状态。这一发现对CRC转录组研究中参考组织的选择具有直接的警示意义，同时也为理解肿瘤周围组织的早期分子改变提供了新的视角。
三、关键技术与方法
研究人员采用了以下主要技术方法：对来自成都中医药大学附属医院的25例CRC患者（13男12女，年龄33至85岁）的配对组织样本进行批量RNA测序，使用Kallisto进行转录本定量并以tximport汇总至基因水平；采用DESeq2进行两两差异表达分析；构建limma线性趋势模型识别沿N-A-T连续谱的单调表达变化基因；基于趋势基因构建N-A-T评分；利用clusterProfiler进行过表征分析（over-representation analysis, ORA）和基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；在TCGA、GTEx和GSE292858外部队列中验证评分；使用Seurat处理GSE132465单细胞RNA测序数据，结合Slingshot进行轨迹推断。
四、研究结果
1. 癌旁黏膜在N-A-T表达连续谱中的转录组定位
主成分分析显示肿瘤组织与两类非肿瘤组织明显分离，而癌旁黏膜与远处正常黏膜大体重叠。两两差异表达分析发现，肿瘤组织与远处正常黏膜相比有3781个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），与癌旁黏膜相比有3951个DEGs，但癌旁黏膜与远处正常黏膜之间未检测到显著DEGs。然而，limma线性趋势模型识别出2695个递增趋势基因和2582个递减趋势基因。代表性趋势基因在癌旁黏膜中的表达水平介于远处正常黏膜和肿瘤组织之间，N-A-T评分同样将癌旁黏膜定位于两者之间。评分对基因集大小不敏感（K=5至50时Spearman ρ范围为0.9735至1.0000），且年龄、性别、解剖部位、T分期和N分期等协变量均不能解释评分模式。
2. 与N-A-T表达连续谱相关的功能程序
ORA分析显示，沿N-A-T连续谱递增的基因主要富集于蛋白质合成和核糖体相关过程，包括核糖核蛋白复合物生物发生、核糖体生物发生、细胞质翻译和rRNA加工；递减基因则主要富集于膜转运和线粒体能量代谢，包括氧化磷酸化、有氧呼吸和呼吸电子传递。Hallmark GSEA表明，朝向肿瘤方向富集的通路包括MYC靶标、E2F靶标、G2M检查点、未折叠蛋白反应和mTORC1信号，而氧化磷酸化、脂肪酸代谢、脂肪生成和异生物代谢则富集于远处正常方向。Reactome GSEA进一步显示肿瘤方向富集主要涉及RNA加工、RNA剪接、前体mRNA加工、tRNA加工和真核翻译起始与延伸。
3. N-A-T评分在独立批量转录组队列中的外部验证
在GTEx与TCGA-CRC联合分析中，正常、癌旁和肿瘤样本的N-A-T评分存在显著差异，ROC分析显示评分区分肿瘤与非肿瘤组织的AUC达0.997。TCGA单独分析中，肿瘤组织的评分显著高于癌旁组织，32对配对样本中肿瘤组织评分普遍高于配对癌旁组织。在独立队列GSE292858中，肿瘤组织评分同样高于非肿瘤组织，配对样本中模式保持一致，AUC为0.966。补充分析显示评分与TCGA肿瘤分期的关联有限。
4. 已确立CRC中与N-A-T评分相关的分子特征
基于单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）的通路相关性分析显示，N-A-T评分与增殖相关Hallmark通路（特别是E2F靶标和G2M检查点）正相关，与多种免疫和炎症相关通路（包括IL6/JAK/STAT3信号、补体、同种异体移植排斥、炎症反应、干扰素γ反应、TNFα经NF-κB信号和干扰素α反应）负相关。ESTIMATE分析表明评分与ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore负相关，与肿瘤纯度正相关。携带SMAD4或BRAF突变的肿瘤评分相对较低，MSI-H肿瘤的评分显著低于MSI-L和MSS肿瘤。探索性生存分析未发现评分与OS、DSS、PFI或DFI存在显著关联。
5. 单细胞分析将N-A-T信号主要定位于上皮细胞
在GSE132465单细胞数据集中，上皮细胞的N-A-T评分最高，其次为基质细胞，而髓系细胞、T细胞、B细胞和肥大细胞评分较低。肿瘤来源上皮细胞的评分高于正常来源上皮细胞，且该差异在样本聚合水平上保持一致。Slingshot轨迹推断显示肿瘤来源上皮细胞的主线伪时间值整体高于正常来源上皮细胞，伪时间与N-A-T评分呈正相关（Spearman ρ=0.366, P<0.001）。沿伪时间轴，分化相关基因模块总体下降，而增殖、干性和肿瘤相关基因模块上升，FABP1沿伪时间下降，MKI67、OLFM4和CEACAM6向晚期伪时间状态上升。
五、讨论与结论
讨论部分指出，既往研究对CRC癌旁黏膜分子改变程度的报道存在差异，这可能与采样距离、解剖区域、组织组成、细胞类型、平台和分析设计等因素有关。本研究的发现与这一异质性文献一致：癌旁黏膜在两两比较中未呈现明显的肿瘤样表达谱，但配对有序模型检测到了协调的肿瘤定向转录差异。研究结果并不暗示癌旁黏膜代表统一的癌前状态，而是支持组织学非肿瘤组织可能携带空间和情境可变的分子改变这一观点。N-A-T连续谱主要反映上皮转录程序，但组织组成和微环境变化的贡献不能完全排除。研究局限性包括横断面设计无法建立因果关系、25例患者的发现队列可能限制统计功效、缺乏炎症评分和精确采样距离等协变量信息，以及缺乏qPCR、免疫组化、空间转录组学或功能学实验验证。
研究结论为：CRC肿瘤旁黏膜在转录组水平上并非完全等同于远处正常黏膜。配对有序模型揭示了正常–癌旁–肿瘤组织状态间协调的肿瘤定向表达变化，该信号在外部批量队列中可重复，且主要与上皮细胞程序相关。这些发现支持将肿瘤旁黏膜解读为CRC研究中转录组学上发生改变了的参考组织，而因果和机制性结论仍需进一步的实验验证。
