先天性心脏病（CHD）相关心内膜纤维弹力组织增生症（EFE）来源心内膜内皮细胞（EdEECs）的CD144磁分离纯化及内皮-间充质转化（EndMT）体外疾病模型

《Pediatric Cardiology》：In Vitro Models to Study Fibroelastic Remodeling of the Endocardium in Congenital Heart Disease

　　

先天性心脏缺陷（CHD）以病理性心内血流为特征，使心内膜暴露于紊乱的剪切应力。这促进心内膜纤维弹力组织增生症（EFE）的发展，EFE是一种与舒张功能障碍相关的限制性纤维化重塑过程。尽管心内膜在CHD中具有病理机制作用，EFE来源心内膜内皮细胞（EdEECs）仍研究不足。目前尚无标准化方案用于从人类儿科组织中分离和纯化这些细胞。研究纳入N = 15例儿科患者，包括（1）左心发育不良综合征，（2）肺动脉闭锁伴室间隔完整，（3）肺静脉狭窄。免疫组织化学显示内皮-间充质转化（EndMT）。使用基于CD144的磁分离从切除的EFE组织中分离EdEECs。通过流式细胞术、免疫细胞化学和RT-qPCR评估心内膜表型的富集。为模拟疾病样条件，将EdEECs暴露于体外剪切应力和转化生长因子β₁（TGF-β₁）。在不同CHD患者的左心室、右心室和左心房中观察到由EECs纤维化激活经EndMT驱动的EFE。基于CD144的磁分离提供了一种可靠、温和的方法，从心脏组织中纯化EdEECs，达到>95%纯度，同时在蛋白和基因表达水平可重复地保持心内膜身份。分离的EdEECs在静态和高剪切应力下保留其内在的、疾病特异性EndMT易感性和脆弱性。与健康EECs（HEECs）不同，单独的生理性低剪切应力不足以恢复EdEECs内在的纤维化脆弱性。在不同CHD实体中观察到EndMT介导的EFE。一种从EFE组织分离和纯化EdEECs的可重复方案保留了其心内膜表型和疾病特异性特征。这为研究EdEEC特异性信号通路提供了模拟疾病的体外模型。

先天性心脏病（congenital heart defects, CHD）是一类出生时心脏结构异常，常伴病理性心内血流，使心内膜暴露于紊乱剪切应力（shear stress），促进心内膜纤维弹力组织增生症（endocardial fibroelastosis, EFE）发生。EFE是心内膜下纤维弹力组织病理性增厚，属于限制性纤维化重塑，与舒张功能障碍和心室发育受损相关，增加CHD患儿病残和死亡，并限制左心室（left ventricle, LV）作为体循环心室的应用。既往研究表明，EFE的关键驱动为心内膜经内皮-间充质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT）发生纤维弹性重塑；患者心内膜内皮细胞（endocardial endothelial cells, EECs）易在病理血流下丢失内皮标志并获得间充质标志，经TGF-β/SMAD信号及Slug/Snail、TWIST等转录因子调控。但EFE来源心内膜内皮细胞（EFE-derived endocardial endothelial cells, EdEECs）仍研究不足，缺乏从人类儿科组织分离和纯化的标准化方案。现有研究多聚焦左心发育不良综合征（hypoplastic left heart syndrome, HLHS）的LV，并依赖酶消化EFE组织得到的混合细胞群，限制对EdEECs特定病理机制的解析。临床观察提示其他CHD也存在不成比例的纤维组织堆积，提示EndMT介导心内膜重塑可能更普遍。因此，研究人员旨在研究不同CHD实体中是否存在EndMT介导的EFE，并建立从儿科CHD患者分离和磁纯化EdEECs的新方案。

研究人员纳入N = 15例儿科患者，包括HLHS（N = 6）、室间隔完整型肺动脉闭锁（pulmonary atresia with intact ventricular septum, PA-IVS，N = 4）和肺静脉狭窄（pulmonary vein stenosis, PVS，N = 5），这些患者在Boston Children’s Hospital于2024年6月至2025年7月接受心室康复手术或解剖聚焦修复手术。研究人员从切除的EFE组织分离EdEECs，采用基于CD144的磁分离，并以流式细胞术（flow cytometry）、免疫细胞化学（immunocytochemistry）和定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR）评估心内膜表型富集；随后在体外剪切应力和转化生长因子β₁（transforming growth factor beta 1, TGF-β₁）条件下模拟疾病样环境。结果显示，EndMT介导的EFE在不同CHD的LV、右心室（right ventricle, RV）和左心房（left atrium, LA）中均可观察到；基于CD144的磁分离可可靠、温和地纯化EdEECs，纯度>95%，并在蛋白和基因表达水平可重复保持心内膜身份；分离的EdEECs保留内在的疾病特异性EndMT易感性；与健康心内膜内皮细胞（healthy endothelial cells, HEECs）不同，单纯生理性低剪切应力不足以恢复EdEECs的内在纤维化脆弱性。该研究意义在于提供可重复的疾病模拟体外模型，用于研究EdEEC特异性信号通路，并可能支持未来治疗靶点发现。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用儿科心脏手术切除组织队列，N = 15，包括HLHS（N = 6）、PA-IVS（N = 4）和PVS（N = 5），来源为Boston Children’s Hospital，2024年6月至2025年7月；HEECs来自心血管健康儿科供体尸检。关键技术包括纤维弹性组织消化与基于CD144的磁分离纯化EdEECs，流式细胞术、免疫细胞化学/免疫荧光和RT-qPCR检测内皮、心内膜和间充质标志；TGF-β₁刺激实验；ibidi流动系统施加7.5、0、40 dyn/cm²剪切应力；EdU掺入增殖试验评估细胞活力；GraphPad Prism 10统计分析。

研究结果：
Patients（患者）：纳入N = 15例儿科患者，包含HLHS、PA-IVS、PVS，接受心室康复或解剖聚焦修复手术，患者特征得到总结。
Fibrotic Tissue Identifies as Endocardial Fibroelastosis Driven by EndMT（纤维化组织鉴定为由EndMT驱动的EFE）：组织学显示不同CHD实体和心脏部位的心内膜下增厚主要由有序胶原和弹性纤维层组成，提示EFE纤维弹性重塑；免疫荧光显示EECs同时表达内皮标志CD31和间充质标志vimentin，位于心内膜下表面和浸润心肌内，提示EndMT；该现象不仅见于HLHS的LV，也见于其他CHD的RV和LA。
Representative Results from Successful Magnetic CD144 Isolation of EdEECs（EdEECs成功CD144磁分离的代表性结果）：
EdEECs Remain Viable（EdEECs保持存活）：EdU增殖试验显示分离后EdEECs保持存活和增殖，与HEECs增殖率相当。
Morphological Assessment（形态学评估）：10×相差显微镜显示天然培养呈纺锤形间充质样，纯化培养呈内皮特征性鹅卵石样单层，EdEECs形成汇合单层并保留细胞间连接，CD31强表达。
Enrichment of Endocardial Endothelial Phenotype at the Protein Level（蛋白水平心内膜内皮表型富集）：流式细胞术分析每样本至少30,000个单细胞，磁分离后CD31⁺ EECs显著增加（P = 0.0001），成纤维细胞阳性细胞显著减少（P = 0.041），发生EndMT的EdEECs显著减少（P = 0.0262）；CD31表达增加80.6倍（P = 0.0006），成纤维标志表达下降0.59倍（P = 0.0270）；纯化细胞保留心内膜谱系，NFATC1⁺细胞达98.9%，并呈CD31⁺/NFATC1⁺双阳性。
Enrichment of Endocardial Endothelial Phenotype at the Transcriptional Level（转录水平心内膜内皮表型富集）：qRT-PCR显示纯化后心内膜特异标志NFATC1（P = 0.0262）、NPR3（P = 0.0299）及内皮标志PECAM1（P = 0.0175）显著上调；间充质标志ACTA2（P = 0.0530）、COL1A1（P = 0.6200）和转录因子SNAI2（P = 0.4557）无显著变化。说明EdEECs可富集心内膜内皮表型，但仍保留EndMT内在倾向。
Purified EdEECs Retain Disease-Specific Characteristic Under Disease-Like Conditions（纯化EdEECs在疾病样条件下保留疾病特异性特征）：
Purified EdEECs are Responsive to TGF-β1 Exposure（纯化EdEECs对TGF-β₁暴露有响应）：100 ng/mL TGF-β₁刺激48 h后，每100个CD31⁺ EdEECs的平均α-SMA表达显著增加（P = 0.0073），表明纯化EdEECs仍对TGF-β/SMAD信号有响应并发生EndMT。
Purified EdEECs are Responsive to Flow（纯化EdEECs对流动有响应）：EdEECs和HEECs在7.5 dyn/cm²（生理低剪切应力）、0 dyn/cm²（静态）和40 dyn/cm²（高剪切应力）下暴露48 h；静态和高剪切应力较生理剪切应力显著增加vimentin双阳性EdEECs（P = 0.0414）；静态和高剪切应力均诱导EndMT（P = 0.0375和P = 0.0045），二者无显著差异（P = 0.6417）。HEECs在静态和高剪切应力下出现部分双阳性，但差异无统计学意义（P = 0.9769）；EdEECs比HEECs更易感（P < 0.0001），即使在生理低剪切应力下也显示更纤维化表型。这些结果表明分离EdEECs保留流动响应性和疾病特异性。

讨论部分总结：该研究证明纤维化激活的EdEECs在不同CHD中发生EndMT，强调心内膜在CHD病理中的中心作用。研究提供从儿科CHD心脏分离、纯化和培养EdEECs的详细可靠方案，并显示该方案可扩展至HLHS之外的RV和LA。分离EdEECs可重复保留心内膜表型及EndMT内在倾向，保持存活并对改变剪切应力和TGF-β/SMAD信号响应。EFE不限于LV，也见于RV和LA，提示EndMT介导纤维化重塑是跨心腔的可泛化致病机制。由于EECs在心脏发育和疾病中重要但研究不足，主要瓶颈是难以从人类组织获得足够纯度EdEECs且无详细方案；儿科EECs具有独特转录/蛋白谱、细胞未成熟和遗传易感性，商业内皮细胞系不能替代。现有方案多依赖动物模型、健康心脏EECs、靶向敲低、全组织消化无标志分选、样本小或重复性不足，且偏重一般内皮标志，导致混合心脏成纤维细胞。该方案通过CD144磁分离解决这些问题；NFATC1作为心内膜转录因子，但胞内标记需透膜，故用表面CD144温和分离，仍获得>95% NFATC1⁺ EdEECs。流动实验显示仅生理剪切应力不足以恢复EdEECs表型，与临床EFE复发和再干预率高一致，提示需辅助治疗恢复EndMT潜能至健康基线。局限性包括样本量小、可能不可泛化、纤维化组织中心肌污染不能完全排除、EdEECs动态异质、单向流不能模拟湍流。

研究结论翻译：总之，通过EndMT介导的EFE存在于不同CHD中。EdEECs可被成功分离、纯化和培养用于下游应用。EdEECs可重复地保留其心内膜内皮表型以及对已确立的EndMT相关刺激的响应性。该方案为研究EdEECs中的疾病机制和信号通路提供了可靠的体外疾病模型。