《Lab on a Chip》：Three-dimensional imaging flow cytometry: current trends and future perspectivesOpen Access
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成像流式细胞术（imaging flow cytometry, IFC）将显微技术与流式细胞术相结合，可在实现高通量、群体规模单细胞分析的同时提供丰富的空间细节和高分子特异性。迄今为止，大多数已建立的IFC平台均以二维（2D）成像为核心构建，其在捕获流动状态下
成像流式细胞术（imaging flow cytometry, IFC）将显微技术与流式细胞术相结合，可在实现高通量、群体规模单细胞分析的同时提供丰富的空间细节和高分子特异性。迄今为止，大多数已建立的IFC平台均以二维（2D）成像为核心构建，其在捕获流动状态下单细胞的复杂三维（3D）形态、胞内组织及空间分布分子特征方面具有固有局限性。在体积细胞信息需求不断增长的驱动下，IFC已通过多种光学与计算策略从2D成像逐步演进至三维成像流式细胞术（3D IFC）。现有3D IFC方法通常根据体积信息是通过顺序采集还是并行采集组装，而分为基于扫描（scanning-based）与非扫描（non-scanning）两种模式；每种模式在3D成像性能与细胞计量通量方面具有互补优势。研究人员系统比较了最具代表性的基于扫描与非扫描3D IFC技术的基本原理和性能特征，并讨论了在生物医学与转化研究中推进体积细胞计量分析所面临的当前挑战与未来机遇。
1 引言
成像流式细胞术（imaging flow cytometry, IFC）将显微成像与流式细胞术相结合，使高通量群体规模的单细胞分析具备空间细节与分子特异性，但传统IFC基于二维（2D）成像，轴向信息缺失导致三维细胞结构被压缩为平面投影，难以准确反映细胞与细胞核形态、细胞器分布及染色质空间定位等表型。恢复轴向维度后，三维成像流式细胞术（3D IFC）可对三维形态、内部拓扑和空间异质性进行直接量化。实现体积成像的核心挑战在于平衡空间分辨率、采集速度与系统复杂度，由此形成了基于扫描（scanning-based）与非扫描（non-scanning）两类技术路线。
2 基于扫描的3D IFC技术
2.1 基于荧光的学层切3D IFC
此类方法通过顺序采集不同焦面或照明平面来组装体积信息。倾斜/斜置微通道结构利用流动细胞的平移作为被动轴向扫描器，配合三维反卷积重建细胞体积。光片显微镜（light-sheet microscopy, LSM）提供内在光学层切能力，并通过晶格光片、声光可调透镜、声流聚焦和并行多片照明等方式不断改善轴向约束、光子效率与通量。光流控集成平台将光片生成、波导和微通道集成于芯片，提高了系统稳定性与可扩展性；开源、模块化和便携式系统则降低了使用门槛。共聚焦方案通过点扫描照明与针孔滤波实现光学层切，基于频分复用的超快共聚焦可突破荧光寿命限制，实现高速流动下的三维成像。通过时空变换编码和并行斜平面检测，每秒超过2000个细胞的体积采集已得到验证。该类方法仍受流速与轴向采样密度、多色成像光子预算、光照功率和重建复杂度之间的折中约束。
2.2 体积定量相位IFC
免标记定量相位成像（quantitative phase imaging, QPI）利用细胞固有的折射率（refractive index, RI）与光学相位实现无外源标记的定量表征。数字全息可单次恢复复光场，而光学衍射层析（optical diffraction tomography, ODT）通过多角度投影重建三维RI分布。在微流控环境中，细胞在剪切流中的自旋提供了角度多样性，使全息断层扫描无需机械旋转。该类方法面临缺失锥问题、弱散射近似（Born/Rytov近似）在厚样品或强散射样品中的失效，以及有限角度采样导致的轴向分辨率下降。采用改进的逆散射模型和基于深度学习的重建算法可部分补偿上述问题。非干涉式方法如光强传输方程（transport-of-intensity equation, TIE）成像具有结构简单的优势，但通常需要多帧采集。体积RI图可在无标记条件下识别细胞核、脂滴等亚细胞结构，并与荧光方法形成互补。
2.3 基于散射的3D IFC
基于散射的3D IFC利用细胞内部RI不均匀性对入射光的散射来获取体积信息。传统前向散射和侧向散射仅提供低维指标，而结合时空变换、单像素探测和计算重建后，可恢复流动细胞的3D散射图像。无相机3D侧散射IFC通过光片扫描与空间滤波编码，以光电倍增管信号重建体积散射分布；3D前向散射IFC则采用针状光束照明和微镜阵列轴向扫描，结合时空反卷积以每秒数百个细胞的通量重建形态与RI梯度信息。散射体积通常被视为经验性结构指纹而非绝对定量图，其测量强烈依赖照明与收集几何，跨平台可重复性需要借助标准参考颗粒进行校准。该类方法适合免标记分类、形态质量控制、双联体检测等相对比较场景。
3 非扫描式3D IFC技术
3.1 多焦点3D IFC
多焦点方案通过单次曝光同时采集多个轴向平面，避免顺序扫描带来的速度限制。虚像散焦阵列（virtually imaged defocused array, VIDA）利用标准具生成多个轴向偏移反射，在单次100 μs曝光内获得完整焦面堆栈，已用于白细胞核形态计量。八焦点平面成像系统通过棱镜将光束分为八路并配合双相机，可在单次曝光中重建三维流场并追踪粒子。点扩散函数（point-spread function, PSF）工程通过引入像散将发射体深度编码为椭圆取向与纵横比，实现了高速、纳米级、多色三维定位IFC，适用于染色质组织和纳米颗粒摄取研究。
3.2 光场流式细胞术（LFC）
光场显微镜（light-field microscopy, LFM）通过微透镜阵列同时记录光场的空间与角度信息，可从单次二维曝光经波动光学反卷积重建三维体积。光场流式细胞术（light-field flow cytometry, LFC）将傅里叶光场成像与流体聚焦和频闪照明结合，实现了近衍射极限的各向同性分辨率与每秒数千个细胞的高通量体积分析；后续LFC-plus通过光谱孔径分割扩展多色和近毫米级视场采集，并将分析通量提升至约200 000细胞/秒。补丁反卷积可将重建速度提高20–40倍。LFC仍面临分辨率-视场-光子效率折中、微透镜阵列像差、标定复杂度以及迭代反卷积计算负担等挑战。
4 3D IFC的应用
4.1 单细胞形态计量与几何表型分析
三维形态描述符如体积、表面积、球形度、伸长率、核分叶程度和核质比无法从二维投影唯一确定。倾斜通道、共聚焦断层以及单曝光多焦点方案已被用于白细胞核形态、红细胞变形和有丝分裂期判别等研究；免标记前向散射重建也可恢复未标记细胞的形态与尺寸信息。
4.2 生物物理表型分析
将三维成像与弯曲/缩窄微通道结合可评估细胞变形性及刚度依赖性流动行为。流动光学衍射层析可获得免标记三维RI图，进而计算干质量、胞内密度和内部光学异质性；散射型3D IFC则通过体积散射指纹直接实现细胞分类，并为白细胞亚型区分提供免标记途径。
4.3 细胞器水平细胞内结构与纳米尺度3D定位
光片体积细胞计数可实现线粒体网络的三维重建和多通道细胞器并行分析；晶格光片和结构化照明降低了光毒性并提升了分辨能力。PSF工程可在流动中实现纳米级三维定位，用于染色质组织和纳米颗粒分布的量化；LFC可从单张快照解析细胞器三维组织并揭示细胞间异质性。
4.4 药物递送、细胞反应与治疗谱分析
多色光片体积细胞计数可量化药物诱导的细胞器网络重构和凋亡特征；LFC已用于凋亡可视化、脂质纳米颗粒介导的mRNA递送定量以及化疗谱分析；PSF工程IFC可绘制纳米颗粒的胞内分布；全息断层流式细胞术在免标记条件下用于药物耐药表型分析；无相机3D侧散射IFC还可量化辐射诱导的核内γH2AX焦点。
4.5 临床与转化单细胞诊断
断层相位成像结合机器学习可区分肿瘤细胞与白细胞并鉴别肿瘤亚型；全息断层流式细胞术已用于急性髓系白血病原始细胞的三维核特征分析及NPM1突变相关表型鉴定。光学层切和全息IFC已用于全血中稀有肿瘤细胞的回收与识别。该领域的未来关键不仅是成像能力，更需要在连续患者样本中验证诊断准确性。
4.6 多细胞模型与完整生物体
光片IFC平台已实现浮游植物叶绿素a三维结构、线虫、斑马鱼以及三维球体等标本的体积成像。此类应用的限制主要来自可控、无损伤的样本输送与取向控制，而非成像本身。
4.7 微流控计量学
同时多平面成像可基于示踪粒子重建瞬时三维流场，用于血管分叉等复杂几何中的径向迁移和近壁动力学测量；体积定量相位成像已用于液滴和微反应器内浓度场、混合动力学及界面行为的原位测量。这类应用强调绝对位置精度，用于刻画影响细胞测量的流体力学环境。
5 讨论与展望
3D IFC的发展始终围绕深度编码方式、探测架构和解码速度之间的权衡。硬件层面，超薄光学超表面与微流控的集成有望实现紧凑、多功能的三维光学编码；可编程光束整形和数字自适应光学可用于补偿流动系统中的像差。探测方面，单光子雪崩二极管（SPAD）阵列和事件相机可在降低读出噪声的同时提供荧光寿命或异步稀疏数据采集能力。人工智能（AI）正被用于加速体积重建、免标记细胞分类和行为预测，并推动图像激活细胞分选向实时闭环方向发展。未来3D IFC有望成为集体积成像、智能分析和主动分选于一体的自主化平台，在基础细胞生物学、精准诊断和靶向治疗研发中发挥重要作用。
