阿斯巴甜暴露相关神经行为改变与代谢失调：网络毒理学、分子对接和体内评价的整合研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Aspartame Exposure-Associated Neurobehavioral Alterations and Metabolic Dysregulation: An Integrated Study Using Network Toxicology, Molecular Docking, and In Vivo Evaluation

　　

阿斯巴甜暴露相关神经行为改变与代谢失调：采用网络毒理学、分子对接和体内评价的整合研究。网络毒理学和分子对接识别了用于体内验证的候选靶点。高剂量阿斯巴甜与较差的记忆和海马炎症改变相关。高剂量阿斯巴甜与胰岛素抵抗和肝脏脂质蓄积相伴随。高剂量阿斯巴甜与大鼠肠道微生物组成改变相关。

一、研究背景与科学问题

人类偏好甜味，但现代加工食品、甜点和饮料中糖含量升高，与全球肥胖和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T₂DM）增加相关。人工甜味剂（artificial sweeteners, AS）及非营养性甜味剂（non-nutritive sweeteners, NNS）因甜度高、热量低而被广泛使用。阿斯巴甜（aspartame, APM）由L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸构成，甜度约为蔗糖200倍，几乎无热量。世界卫生组织（WHO）关于NNS的指南提示，长期使用NNS可能与成人T₂DM、心血管疾病和死亡风险增加相关。APM暴露还与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、记忆损害、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）和某些癌症等关联。其神经生物学改变可能涉及氧化应激、蛋白稳态紊乱和神经炎症；动物研究显示慢性中高剂量APM与氧化应激增加、SIRT1/FOXO3a介导自噬失调、α-synuclein和磷酸化tau累积以及阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）和PD模型神经退行性改变加重相关。甲醇代谢和天冬氨酸相关兴奋毒性可能与小胶质反应性、促炎反应、神经元损伤和认知改变相关。代谢方面，APM暴露可能与脂代谢和糖稳态紊乱相关，机制涉及关键脂代谢酶、PPARγ/SREBP信号和肠道菌群改变；体外研究显示高浓度或长期APM暴露伴随ANKRD11/ZIPK/STAT3信号抑制和胰腺β细胞caspase依赖凋亡增加。APM半衰期约1小时，代谢为苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）、天冬氨酸（aspartate, Asp）和甲醇（methanol, MeOH）；MeOH半衰期约3小时，转化为甲醛和甲酸。当前问题在于，APM神经行为和代谢效应虽被广泛报道，但分子基础不足；其潜在靶点及主要代谢物与体内多系统表型之间联系未充分阐明。因此，研究人员采用网络毒理学（network toxicology）、分子对接（molecular docking）和体内评价整合策略，进行从计算预测、候选靶点筛选、动物表型到分子改变的多层次分析。

二、主要关键技术方法

网络毒理学从PubChem获取APM的SMILES，用ProTox 3.0和ADMETlab 2.0预测毒性；用ChEMBL、STITCH、SwissTargetPrediction预测APM及Phe、Asp、MeOH靶点，限制人类且不设阈值；用GeneCards、OMIM、TTD构建AD、PD、T₂DM、肥胖疾病基因集；R软件ggvenn交集，clusterProfiler做基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集，STRING构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，Cytoscape拓扑分析筛选hub基因。分子对接用PubChem配体和RCSB PDB蛋白PPARγ、EGFR、HDAC1、RXRA、IL-1β，AutoDock Vina和PyMOL。体内用雄性SD大鼠，6–8周，180–220 g，购自Spefu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.，在特定病原体自由（specific-pathogen-free, SPF）设施饲养，随机分Control、APM-L 75、APM-M 150、APM-H 300 mg/kg/day，灌胃8周；进行Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）、旷场试验（open field test, OFT）、新物体识别（novel object recognition, NOR）、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）、稳态模型评估胰岛素抵抗（homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）、油红O、免疫荧光、蛋白免疫印迹（Western blot）、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）活性、实时定量PCR（quantitative PCR, qPCR）和16S rRNA基因测序。动物伦理批号2026081。

三、研究结果

3.1 APM的计算毒性预测：通过ProTox 3.0和ADMETlab 2.0预测，得到APM预测毒性谱和理化性质，为后续毒性相关靶点识别提供初步参考。

3.2 APM及主要代谢物潜在靶点预测：整合APM与Phe、Asp、MeOH预测靶点，获得577个非冗余潜在靶点，建立整合靶点基因集。

3.3 AD、PD、T₂DM和肥胖相关基因集整合：通过多数据库整合构建四种疾病相关基因集，并与APM及代谢物靶点进行交集。

3.4 APM与AD共享靶点的系统识别和功能网络分析：APM及代谢物靶点与3719个AD相关基因交集得115个共享靶点；PPI和拓扑分析得到EGFR、PPARG、HDAC1、IL1B、ITGB1、RXRA、BACE1、ERBB2、HDAC2、PSEN1等前10 hub基因。GO富集于酰胺代谢过程、异生物刺激反应、突触膜和DNA结合转录因子结合；KEGG富集于PI3K–Akt信号通路和AD相关通路。

3.5 APM与PD共享靶点：与3491个PD相关基因交集得102个共享靶点；hub基因包括EGFR、HDAC1、PPARG、IL1B、BACE1、ITGB1、ERBB2、ACE、HDAC2、PSEN1；GO富集于酰胺代谢、突触膜、膜筏、内肽酶活性和DNA结合转录因子结合；KEGG主要为AD相关通路和神经活性配体–受体相互作用通路。

3.6 APM与T₂DM共享靶点：与8235个T₂DM相关基因交集得224个共享靶点；hub基因为HDAC1、RXRA、HDAC2、ITGB1、RXRB、NCOR2、RXRG、PPARG、RARA、ITGB3；GO富集于酰胺代谢、信号释放、异生物刺激反应、突触膜和内肽酶活性；KEGG主要为神经活性配体–受体相互作用和PI3K–Akt信号通路。

3.7 APM与肥胖共享靶点：与342个肥胖相关基因交集得17个共享靶点；hub基因为PPARG、IL1B、ACE、MMP9、DPP4、REN、NOS3、FFAR4、SLC6A3、TH；GO富集于脂多糖反应、细菌来源分子反应、轴突末梢、羧酸结合和内肽酶活性；KEGG主要为神经活性配体–受体相互作用、糖尿病心肌病、脂质和动脉粥样硬化通路。

4 APM与核心靶点分子对接：网络毒理学整合四种疾病共有靶点网络，筛选出EGFR、HDAC1、IL1B、PPARG、RXRA五个核心靶点，这些靶点在至少三种疾病中位列前10。对接显示APM与五个核心蛋白结合能均低于?6.0 kcal/mol，最佳值EGFR ?6.495、HDAC1 ?6.527、IL1β ?6.142、PPARγ ?6.784、RXRA ?6.801 kcal/mol；Phe和Asp也对接受检；MeOH因分子小且结构简单未纳入对接。结论是提供APM和/或代谢物与候选靶点潜在分子相互作用的计算证据，而非证明体内直接调控。

5.2 APM暴露相关神经炎症、海马病理改变和认知功能障碍：MWM显示APM-M和APM-H探针试验逃避潜伏期显著延长，平台穿越次数和目标象限时间减少；OFT显示中高剂量中央区距离和时间减少；NOR显示中高剂量识别指数（recognition index, RI）和新物体探索时间减少。H&E显示海马CA₁、CA₃和DG剂量依赖病理改变；Iba1免疫组化显示Iba1阳性细胞密度增加和小胶质激活形态；血清IL-1β在中高剂量升高，TNF-α仅高剂量升高，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中高剂量IL-1β和TNF-α升高。Western blot显示海马HDAC1在低、中、高剂量均升高，PPARG无显著差异；HDAC脱乙酰酶活性在所有APM组升高。结论为慢性中高剂量APM与空间和识别记忆损害、焦虑样行为、海马结构异常、炎症反应和小胶质反应性增加相关，并伴随HDAC1和HDAC活性升高。

5.3 APM暴露相关全身代谢紊乱、肝脏病理改变和胰岛内分泌细胞组成变化：8周体重、摄食和空腹血糖逐渐上升；OGTT显示APM-M和APM-H在30、60分钟血糖升高，曲线下面积在所有APM组升高；HOMA-IR在中高剂量升高。肝H&E显示中高剂量肝细胞排列紊乱、空泡变性和肿胀；油红O显示中高剂量肝脂滴阳性面积增加。胰腺H&E显示中高剂量轻度至中度损伤；胰岛免疫荧光显示α细胞面积无显著差异，β细胞面积在中高剂量增加，α/β面积比降低。肝Western blot显示HDAC1在中高剂量升高，PPARγ和RXRA在低、中、高剂量降低；qPCR显示PPARG、RXRA在中高剂量降低，CD36和FABP4在所有APM组降低，SREBP-1c在高剂量升高。结论为慢性APM与糖耐量受损、胰岛素抵抗、肝脂质蓄积、肝PPARG/RXRA及脂代谢相关分子改变和胰岛β细胞面积相对扩张相关。

5.4 APM暴露相关肠道菌群失调和潜在功能改变：16S rRNA基因测序比较Control和APM-H，Shannon指数降低，主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）显示两组分离，PERMANOVA证实群落结构差异。Control以Segatella为主，APM-H中Segatella降低，Bacteroides和Phascolarctobacterium增加；线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）显示Control富集Roseburia和Lactobacillus，APM-H富集Bacteroides和机会致病菌Desulfovibrio。KEGG功能预测显示免疫、感染、癌症、运输和分解代谢、碳水化合物和能量代谢、神经系统信号等通路改变。结论为高剂量APM与肠道菌群多样性降低、组成重塑和功能潜力改变相关。

四、讨论与结论翻译

讨论指出，APM及其肠道来源代谢物的健康风险尚未充分评估。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）和美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）分别设定可接受每日摄入量（acceptable daily intake, ADI）为40 mg/kg和50 mg/kg，但含APM产品广泛消费可能超过阈值，尤其低体重儿童。既往8周30和60 mg/kg/day APM暴露降低大鼠脑皮质BDNF、SOD2、Sirt1和mtDNA，增加MDA、TNF-α、IL-6、NF-κB和Bax，提示氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和凋亡。流行病学研究提示每日一份人工甜味饮料使T₂DM风险增加25%（95% CI：18%–33%），代谢综合征风险增加2.2倍，中心肥胖风险增加2.3倍，但存在反向因果、混杂和行为补偿可能。本研究8周大鼠灌胃模型显示，慢性APM暴露与空间和识别记忆损害、焦虑样行为增加、海马HDAC1蛋白升高相关；HDAC1作为表观遗传调节因子可影响神经发生、突触功能和DNA修复。海马H&E病理、Iba-1小胶质反应以及血清和CSF中IL-1β、TNF-α升高提示中枢和外周炎症反应。讨论还提出HDAC1可直接与PPARγ相互作用并调节其乙酰化，HDAC1过表达增强PPARγ去乙酰化并抑制转录活性，但该机制在APM毒性中仍需直接实验验证。肠道菌群方面，高剂量APM降低α多样性并改变β多样性；Roseburia等丁酸产生菌减少可降低短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）水平，削弱对HDAC的抑制，可能是海马HDAC1升高的上游肠源机制；肠上皮PPARγ缺失可加重菌群失调、促进Desulfovibrio扩张和系统性胰岛素抵抗。但本研究仅比较Control和APM-H，未进行粪菌移植等干预，不能建立因果或剂量–反应关系。代谢方面，APM暴露伴随糖耐量受损、HOMA-IR升高和肝脂质蓄积，肝PPARγ、RXRA蛋白降低，PPARG、RXRA、CD36、FABP4 mRNA降低，SREBP-1c mRNA升高；胰岛β细胞面积相对扩张而α细胞面积不变，α/β面积比降低，提示外周胰岛素抵抗下胰岛内分泌细胞代偿性重塑，与APM增强胰岛素分泌、长期高胰岛素血症和胰岛素抵抗的近期证据一致。总体效应可能反映APM及代谢物的综合生物效应，不能归因于完整APM或单一代谢物。Phe可经large neutral amino acid transporter 1通过血脑屏障并与酪氨酸、色氨酸竞争转运；MeOH可进一步代谢为甲醛和甲酸。由于未设置各代谢物单独暴露组，也未直接测定血浆或组织浓度，无法区分不同代谢物相对贡献。局限包括暴露仅8周、仅雄性大鼠、未建立因果、菌群变化不证明因果、低剂量与对照多数无显著差异而不能确定阈值、种间药代和暴露模式差异不能直接外推人类风险。未来需更长暴露、两性、靶向机制干预和合理设计的人体研究。

结论翻译：通过整合网络毒理学、分子对接和体内评价，本研究识别了持续APM暴露与大鼠神经行为改变、全身代谢紊乱和肠道微生物组成变化之间的关联。对海马HDAC脱乙酰酶活性和肝脏脂质代谢相关基因表达的附加分析进一步揭示了涉及HDAC1、PPARγ和RXRA相关过程的分子改变。APM暴露还伴随海马、肝脏和胰腺的组织病理学改变。总之，这些发现为理解持续APM暴露的潜在生物学效应提供了实验证据，尽管其潜在机制和因果关系仍有待阐明。未来研究应进一步探讨更长暴露时间、潜在剂量–反应关系以及易感人群中的暴露风险。