酯键结构倒置增强阳离子脂质体内体逃逸与基因转染效率的研究

《RSC Pharmaceutics》：Structural inversion of ester linkages enhances endosomal escape and gene transfection efficiency in cationic liposomesOpen Access

　　

阳离子脂质的结构构型是决定基因递送性能的关键因素。本研究开展了一项比较性概念验证评估，将同时含有酯键（ester）和反向酯键（reverse-ester）的阳离子两亲分子制备成脂质体载体，并在HEK293T、SKHEP和HEPA细胞系中评估其转染能力。调控脂质双层中酯键与反向酯键的取向及比例，对细胞摄取和细胞内转运产生了显著不同的影响，表明其差异性地参与了内吞途径。此外，这些结构改变显著影响了脂质体表面电荷动力学和胶体稳定性，从而直接调节转染效率。上述结果表明，酯键构型对阳离子脂质体的理化特性和生物活性均具有关键性调控作用。总体而言，本研究建立了酯键与反向酯键脂质构型作为非病毒基因递送比较框架，为优化脂质体设计提供了多功能平台，并拓展了核酸治疗药物的功能应用空间。

一、研究背景与意义

基因治疗依赖于治疗基因的高效递送与表达，这一过程在体内和体外应用中均面临重大挑战。基因递送载体不仅要促进细胞摄取，还需实现成功的内体去稳定化。病毒介导的基因递送和非病毒基因递送是两大主流策略，各有优势与局限。病毒载体虽在历史上发挥重要作用，但常受限于装载容量不足、难以容纳大片段DNA以及转染效率欠佳等问题，制约了其治疗应用前景。

非病毒系统作为多功能替代方案已日益受到关注，涵盖多糖、脂质纳米颗粒、多肽纳米复合物及无机载体等类型。其中，脂质纳米颗粒尤其是脂质体，在mRNA和siRNA治疗药物取得突破后获得了广泛关注。阳离子脂质因其正电荷头基能与带负电的DNA或RNA形成稳定复合物（lipoplexes）而尤为重要。这些疏水分子的结构组织——包括亲水头基、疏水尾链和连接区——对转染效率、细胞摄取和毒性均具有关键影响。

既往构效关系研究已探索多种修饰策略，如改变脂肪链长度与对称性、引入甾体结构以及添加功能基团等。酯键连接的阳离子脂质因具有生物可降解性和较低长期毒性而被广泛采用；相比之下，反向酯键通过氧原子连接疏水尾链，反转了这一取向，可显著改变质子化动力学和脂质膜相互作用，进而影响细胞摄取和内体逃逸效率。然而，酯键与反向酯键取向差异对转染性能的系统性比较研究尚属空白，这正是本研究开展的核心动机。

二、研究内容与主要结论

研究人员设计并合成了一系列同时含有酯键和反向酯键的阳离子两亲分子，以C₁₆H₃₃烷基链为疏水尾部，制备了五种脂质体配方（L1–L5），并在HEK293T正常细胞系、SKHEP和HEPA肝癌细胞系中系统评估其基因递送性能。研究结果表明，所有五种配方均展现出优于商业化转染试剂Lipofectamine? 3000的质粒DNA转染效率。其中配方L3表现最为突出，在2:1电荷比条件下实现了最高的转染率与eGFP表达细胞比例，这与其独特的酯键/反向酯键配比、更高的颗粒浓度以及最强的膜融合活性密切相关。该研究确立了酯键取向作为阳离子脂质化学设计的关键参数，为开发安全有效的非病毒基因递送系统提供了新的设计框架。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术手段：通过动态光散射（DLS）Zetasizer分析测定脂质体的水合粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位；利用纳米颗粒追踪分析（NTA）表征脂质体粒径分布与颗粒浓度；通过琼脂糖凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）评估脂质体与质粒DNA的结合能力；采用MTT还原法评估细胞活力与生物相容性；利用荧光显微镜和流式细胞术定量eGFP表达以评估转染效率；通过荧光共振能量转移（FRET）脂质混合实验定量膜融合活性；并借助氯喹辅助转染实验探究内体逃逸机制。

四、研究结果

阳离子两亲分子的合成与表征： 研究人员设计并合成了含有酯键（E1）和反向酯键（RE1）的阳离子脂质，通过¹H NMR波谱和高分辨质谱确认了目标连接键和烷基链的成功引入。

脂质体纳米载体构建： 将E1、RE1与辅助脂质DOPE按不同摩尔比组合制备脂质体，所有配方在4 °C储存期间保持光学透明，未见明显浑浊或聚集。

Zetasizer分析： 动态光散射测定显示脂质体水合粒径范围为124.40–147.46 nm，zeta电位均为正值（20.96–35.86 mV），其中L1、L3和L4的PDI低于0.3，表明分散均匀。

纳米颗粒追踪分析： 所有配方呈窄的单峰分布，L3展现出最高的颗粒浓度（2.26 × 10¹⁵ mL^?1），提示其具有更多小而分布均匀的囊泡群体，有利于内吞和高效细胞相互作用。

DNA-脂质相互作用评估： 凝胶电泳证实所有配方（L1–L5）均表现出强DNA结合能力，不同配方在1:1至8:1电荷比下展现出细微的结合行为差异。

生物相容性与细胞毒性： MTT实验表明在1:1和2:1电荷比下所有配方均维持高细胞活力，在转染效率最优的2:1比例下细胞毒性极低。

体外转染效率评估： 在HEK293T、SKHEP和HEPA三种细胞系中，2:1电荷比产生最高转基因表达水平，L3展现出优于其他配方的转染效率，这归因于其酯键与反向酯键的优化组合促进了内体膜去稳定化和胞质DNA释放。

脂质体内化与转基因表达： 罗丹明标记实验显示L3和L4具有较高摄取率，但仅L3展现出卓越的基因递送效率，表明内化本身不足以保证高效基因表达，L3的独特结构特征促进了高效内体膜去稳定化。

FRET脂质混合实验： 含DOPE的配方（L1–L4）融合活性显著高于不含DOPE的L5，其中L3在30分钟后达到约85%的荧光恢复，为最高值，表明膜融合受DOPE介导的膜去稳定化和可电离脂质组成共同调控。

氯喹辅助转染实验： 在氯喹预处理条件下，L1、L2、L4和L5的转染效率有所提升，而L3无论是否经氯喹处理均维持高转染效率，表明L3主要通过内在的内吞和内体逃逸机制实现高效基因递送，无需依赖溶酶体向性药物辅助。

五、结论

本研究成功合成并表征了五种阳离子脂质体配方，所有配方在HEK293T、SKHEP和HEPA细胞系中均展现出优于商业化转染试剂Lipofectamine? 3000的质粒DNA转染效率。配方L3表现最为突出，在2:1电荷比下实现增强的基因递送，表现为更高的转染率和更大比例的eGFP表达细胞。这些发现表明疏水性R基团结构域对促进生物分子进入细胞具有重要贡献。总体而言，L3是非病毒基因递送的有前景的候选载体，通过提升递送效率以及生产效率和成本效益，该系统在治疗和疫苗应用中具有广阔前景。未来研究将进一步探索编码治疗性转基因的脂质体载体，重点缓解细胞毒性并优化稳定性，以支持临床转化应用。