《Journal of Cartilage & Joint Preservation》：Engineering a dually perfused miniaturized bioreactor platform to enable multi-tissue knee joint modeling in vitro
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骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是全球范围内导致残疾的主要原因之一，其发病率因人口老龄化而不断上升。尽管该疾病给社会及医疗保健系统带来了日益沉重的负担，但目前仍无改善病情的疗法可用，治疗仅限于症状管理或晚期疾病的手术干预。因此，亟需开发与人相关
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是全球范围内导致残疾的主要原因之一，其发病率因人口老龄化而不断上升。尽管该疾病给社会及医疗保健系统带来了日益沉重的负担，但目前仍无改善病情的疗法可用，治疗仅限于症状管理或晚期疾病的手术干预。因此，亟需开发与人相关的体外模型，以研究疾病的早期发生并预测治疗效果。本研究旨在开发一种双灌流体外生物反应器平台，整合四个相关的膝关节腔室，以支持早期OA疾病建模和药物测试。研究方法包括：利用体积生物打印（volumetric bioprinting, VBP）工程化三周期极小曲面（triply periodic minimal surface, TPMS）小梁骨结构；评估基于生物材料的策略以模拟骨软骨界面的运输功能；优化滑膜成纤维细胞培养条件；同时在滑膜细胞培养条件下评估关节软骨祖细胞（articular chondroprogenitor cells, ACPCs）形成的关节软骨情况。最后，将各腔室组装成双灌流生物反应器，并评估集成培养和灌流的可行性。结果显示，体积生物打印能够制造复杂、矿化的小梁骨样结构；生物材料界面支持尺寸依赖性的腔室间运输；同时获得了表达润滑素（lubricin）和钙黏蛋白-11（Cadherin-11）的滑膜成纤维细胞层；关节软骨祖细胞在滑膜相容的培养条件下支持形成软骨样组织；灌流研究表明，将四个腔室整合至单一生物反应器平台具有可行性。本研究得出结论，此项工作为包含骨、骨软骨界面、滑膜和软骨关键特征的多腔室关节体外模型奠定了技术基础。经过进一步的生物学验证，该平台有望用于早期OA建模及评估与人相关的治疗反应。
一、研究背景与意义
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是最常见的肌肉骨骼疾病，也是全球致残的主要原因之一。全球超过5亿人受其影响，1990年至2017年间发病率增长了9.3%。2020年，全球膝骨关节炎的发病例数估计达8670万。女性患病率显著高于男性，过去30年间增加了132.3%。其他确定的危险因素包括高体重指数（BMI）、久坐不动的生活方式以及既往关节囊创伤性损伤。OA对患者和医疗系统而言是一种高患病率、高成本的疾病，因此对其进行研究并开发合适的体外模型至关重要。许多现有模型主要关注疾病的软骨成分，然而OA影响整个关节，涉及软骨下骨的病理改变、滑膜炎症及其他关节结构的损伤。近年来，膝关节及OA的微流控模型受到关注，因为它们能够重现动态可控的组织微环境。尽管已有研究将软骨外植体或分化的原代软骨细胞与滑膜细胞结合在微流控平台中模拟膝关节，但很少有报道描述包含两种以上关节组织的动态模型，这限制了对维持关节稳态和早期OA发生的多组织串扰的研究。因此，本研究旨在开发一种可双灌流的生物反应器平台，整合小梁骨、骨软骨界面、关节软骨和滑膜四个腔室。
二、关键技术方法
研究人员采用了以下几项关键技术方法：
- 1.
体积生物打印（VBP）：使用Tomolite 1打印机，将人骨髓间充质基质细胞（hMSCs）包埋在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）中，打印成Schwarz G型三周期极小曲面（TPMS）结构，用于构建小梁骨模型。
- 2.
骨软骨界面构建：采用20%（w/v）聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶作为界面材料，通过碘克沙醇（iodixanol）和异硫氰酸荧光素标记菊粉（FITC-Inulin）扩散实验评估其对不同分子量探针的尺寸依赖性传输特性。
- 3.
滑膜与软骨共培养评估：将滑膜成纤维样细胞培养于5% GelMA圆盘表面，通过免疫荧光检测钙黏蛋白-11（Cadherin-11）和PRG4/润滑素（lubricin）的表达；将预分化21天的关节软骨祖细胞（ACPCs）来源的软骨盘转移至滑膜成纤维细胞培养基中继续培养7天，通过组织化学和生化分析评估其分化标志物的维持情况。
- 4.
生物反应器组装与灌流验证：定制设计并制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）内腔和聚对苯二甲酸乙二醇酯-乙二醇（PETG）外壳的生物反应器，将无细胞的各水凝胶组件组装后连接蠕动泵，分别以不同流速灌流不同粒径的荧光微珠，通过成像验证腔室的独立灌流性和密封性。所有细胞均来源于接受脊柱融合术或髋关节置换术患者的骨髓抽吸物（hMSCs）、全膝关节置换术患者的OA软骨（ACPCs）及滑膜组织（滑膜成纤维样细胞），获取符合荷兰乌得勒支大学医学中心伦理规定。
三、研究结果
1. 体积生物打印可实现支持成骨分化的大孔、载细胞水凝胶网络的制备
VBP可快速制造厘米级、高设计自由度的结构。打印的Schwarz G结构呈现复杂互通的通道网络。载MSCs的构建体经21天成骨诱导分化后，microCT显示其保持形状且具有互通的开孔网络。分化样本宏观呈白色不透明状，硬度足以支撑自身重量，表明细胞外基质沉积和矿化发生。组织学染色显示分化打印体支柱中遍布钙沉积（茜素红和Von Kossa染色阳性），细胞外基质含I型胶原而不含II型胶原，证实形成了骨样基质。
2. 工程化界面可作为小梁骨与关节软骨之间的传输屏障
为模拟骨软骨界面的传输特性，研究人员比较了20% PEGDA和20% GelMA两种水凝胶。碘克沙醇（1.5 kDa）扩散实验显示两种水凝胶均允许该小分子探针被动传输，但PEGDA的传输速率较慢。FITC-菊粉（2-5 kDa）跨孔扩散实验表明，GelMA在30-60分钟内即达到平衡，高度通透；而PEGDA在120分钟内传输量低两个数量级，显著限制了该分子量的探针通过。因此，20% PEGDA被选为界面材料。
3. 软骨在滑膜培养基中维持分化特征
滑膜成纤维样细胞在5% GelMA表面培养10天后，形成紧密单层，表达钙黏蛋白-11和润滑素。预分化21天的ACPCs软骨盘在滑膜成纤维细胞培养基中继续培养7天后，糖胺聚糖（GAG）沉积、Safranin-O染色及II型胶原免疫组化信号均得以维持，与持续在软骨分化培养基中培养的样本无显著差异，GAG/DNA含量也无统计学差异，证明在滑膜培养基中可维持软骨分化表型。
4. 生物反应器组装与微珠灌流
将无细胞的水凝胶组件（5% GelMA用于滑膜和软骨，20% PEGDA用于界面，VBP骨构建体置于骨腔室）组装入PDMS内腔和PETG外壳中。平台可重复组装、无气泡，且在37°C下48小时内保持无泄漏。小型微珠（125-150 μm）以150 μL/h流速成功通过VBP Schwarz G结构的多孔网络，大型微珠（450-500 μm）以400 μL/h流速顺利通过软骨-滑膜腔室，均未观察到泄漏至玻璃片或外部外壳的情况。
四、讨论与结论
讨论总结：本研究展示了VBP载MSCs陀螺体的成骨分化，提出了模拟膝关节骨软骨界面扩散截断的材料策略，研究了预分化工程化关节软骨在滑膜成纤维细胞培养基中的培养，并提供了双灌流生物反应器平台的概念验证。该平台包含两条独立灌流线路和腔室，可容纳高细胞密度的水凝胶组分，有望整合四种模拟膝关节关键组织特征的腔室进行建模。与其他研究相比，本模型独特之处在于使用了更复杂的制造策略（如VBP）以改善细胞分化和流体流动，并采用PDMS这一广泛用于微流控平台制造和机械驱动的材料。然而，该平台也面临挑战，如易污染、组装流程长、需双泵线及大量外围设备导致通量受限、长期培养中细胞可能浸润分隔材料改变其性能等。未来应聚焦长期灌流、疾病特异性刺激、慢性暴露于炎症或毒性化合物以及药物反应的验证。
研究结论翻译：研究人员成功展示了一个双灌流生物反应器平台的概念验证，该平台包含天然膝关节组织结构关键的四种组织，并有可能用于研究OA的早期发生。通过将体积生物打印的大孔小梁骨、骨软骨界面、源自ACPCs的关节软骨以及滑膜衬里整合在一个模块化平台中，这项工作为开发更具生理相关性的关节模型奠定了基础。独立灌流腔室的使用进一步实现了对不同组织区域的可控流体通路。这种复杂且高度相关的模型有望将多个组织腔室整合到单个微流控装置中，以进一步再现天然滑膜关节。
