《Journal of Controlled Release》：Annexin A5-engineered nanovaccines synchronize spatiotemporal antigen release with phagocytosis checkpoint blockade for potent in situ cancer immunotherapy
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•一种纳米疫苗将光动力治疗与按需磷脂酰丝氨酸屏蔽相结合，实现原位疫苗接种。•活性氧响应性聚乙二醇脱落使膜联蛋白A5阻断磷脂酰丝氨酸介导的胞葬清除。•该平台增强树突状细胞成熟，重极化肿瘤相关巨噬细胞，并激活T细胞。•该系统抑制原发肿瘤和远处肿瘤，并提供再挑战保护。引言癌症疫苗作
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一种纳米疫苗将光动力治疗与按需磷脂酰丝氨酸屏蔽相结合，实现原位疫苗接种。
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活性氧响应性聚乙二醇脱落使膜联蛋白A5阻断磷脂酰丝氨酸介导的胞葬清除。
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该平台增强树突状细胞成熟，重极化肿瘤相关巨噬细胞，并激活T细胞。
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该系统抑制原发肿瘤和远处肿瘤，并提供再挑战保护。
引言
癌症疫苗作为一种有前景的主动免疫治疗形式，在癌症治疗中展现了可观的潜力。通过刺激免疫系统并诱导持久的免疫记忆，癌症疫苗在原发肿瘤治疗和复发预防方面均具有重大前景 [1], [2]。然而，尽管前景广阔，当前的癌症疫苗仍面临若干挑战。首先，肿瘤异质性和免疫逃逸限制了现有疫苗产生强大且广泛免疫反应的能力 [3], [4]。此外，费力的体外疫苗生产流程——包括肿瘤标本采集、新抗原鉴定、复杂的配方以及监管障碍——使临床转化变得复杂 [5], [6]。自体肿瘤细胞通过提供全面的肿瘤相关抗原表位，为疫苗开发提供了理想的来源 [6], [7], [8]。在体内原位生成自体肿瘤细胞疫苗简化了制备过程，并允许针对每位患者独特的肿瘤特征进行个性化定制，为唤起个体化免疫反应提供了一种颇具吸引力的接种策略 [9], [10]。
在当前的癌症治疗策略中，光动力治疗（PDT）作为一种不仅能实现精确时空肿瘤细胞杀伤，还能诱导肿瘤相关抗原（TAA）原位产生的策略而崭露头角，涵盖新抗原和此前隐藏的表位，从而为免疫识别创造强大的内源性抗原库 [11], [12], [13]。然而，PDT过程中凋亡肿瘤细胞表面同时暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）可介导免疫抑制性清除 [14]，限制了有效的抗原呈递和下游抗肿瘤免疫。这种外化的PS充当强烈的"吞噬我"信号，招募吞噬细胞——尤其是巨噬细胞——来吞噬濒死细胞 [15], [16]。尽管PS是胞葬作用中主要的吞噬我信号，但濒死细胞的识别由多种吞噬线索协同调控，包括钙联蛋白和其他吞噬我信号。虽然PS介导的凋亡细胞清除在生理上是必要的——通过清除自身抗原来防止自身免疫——但在癌症中，它却悖论性地抑制了抗肿瘤免疫，因为在肿瘤细胞的抗原能被抗原呈递细胞（APC）有效呈递之前，就将其清除掉了 [17], [18], [19], [20]。此外，吞噬凋亡肿瘤细胞的巨噬细胞通常极化为免疫抑制性的M2表型，促进免疫逃逸 [21], [22], [23], [24]。濒死细胞的识别由多种吞噬线索协同调控，包括PS、钙联蛋白和其他吞噬我信号。PS的识别通常驱动耐受性胞葬作用和M2样巨噬细胞极化以及沉默的抗原降解，而细胞表面的钙联蛋白与CD91结合，授权抗原呈递细胞进行强有力的抗原交叉呈递和促炎性激活。因此，通过解耦PDT诱导的凋亡与胞葬介导的免疫抑制来选择性抑制PS暴露，对于增强肿瘤特异性免疫反应具有巨大的潜力。鉴于PS失调在促进免疫抑制中的关键作用，阻断PS介导的免疫耐受的策略对于提高自体肿瘤细胞原位疫苗的功效至关重要。
膜联蛋白A5（ANX5）是钙和磷脂结合蛋白家族的一员，以高亲和力结合磷脂酰丝氨酸（PS），已被广泛用于检测凋亡细胞 [25], [26], [27]。ANX5阻断PS暴露作为靶向免疫检查点策略来增强肿瘤抗原特异性疫苗的免疫原性具有相当大的潜力。然而，由于PS也会短暂暴露于某些正常细胞上，包括血小板、巨核细胞和肌母细胞，全身性的PS阻断可能导致脱靶毒性 [28], [29], [30]。这凸显了选择性、按需呈现ANX5并特异性靶向凋亡肿瘤细胞的必要性。此外，PS暴露发生在PDT诱导的肿瘤凋亡早期，如果不加限制，可能建立一个抑制性微环境，限制有效的抗原呈递 [31], [32]。尽管已有报道称PDT可诱导肿瘤细胞凋亡并促进抗原暴露，但很少有策略将PDT诱导的抗原释放与PS介导的免疫抑制在体内的精确时空控制相结合，这是充分利用肿瘤衍生抗原免疫原性的关键障碍。因此，将PDT诱导的抗原释放与精确的ANX5介导的PS阻断相结合的顺序协调策略，对于最大化肿瘤抗原保留、减轻免疫抑制和增强强有力的抗肿瘤免疫至关重要。
在本研究中，我们介绍了一种经过策略性工程的细胞衍生纳米囊泡，该囊泡巧妙地将PDT诱导的原位抗原产生与按需PS阻断相结合，以增强抗原特异性免疫接种并克服免疫耐受。首先，合成了一种具有强活性氧生成能力的有机光敏剂，并将其组装成坚固的纳米内骨架。光激活后，纳米核产生大量活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡，同时触发肿瘤特异性抗原的释放。为减轻PS介导的免疫抑制性清除，PDT纳米核被封装在显示ANX5的肿瘤细胞膜衍生囊泡中，并进一步用活性氧可切割的聚乙二醇冠层进行屏蔽，以最小化与正常细胞的脱靶相互作用。肿瘤部位的局部光照射触发聚乙二醇切割，促进纳米囊泡在肿瘤部位的激活。PDT诱导的细胞毒性将肿瘤细胞转化为肿瘤特异性抗原库。与此同时，细胞膜上的ANX5与PDT诱导的凋亡细胞上暴露的PS结合，减弱PS依赖性吞噬清除，促进下游免疫激活。PS暴露的凋亡细胞清除减少有利于向继发性坏死发展，这是一种高度免疫原性的细胞死亡形式，释放损伤相关分子模式（DAMPs），进一步放大抗肿瘤免疫。在小鼠肿瘤模型中，这些纳米囊泡抑制了原发肿瘤和转移肿瘤的生长，延长了总生存期，并通过促进适应性抗肿瘤反应引发了持久的免疫保护。此外，该系统增强了凋亡肿瘤细胞的免疫原性后果，并重编程巨噬细胞功能以协同放大免疫效应。通过将高性能光敏剂的强效PDT效应与经基因工程改造的膜囊泡进行活性氧响应性PS屏蔽相结合，这种多功能纳米平台为提高个性化原位癌症疫苗的功效提供了一种有吸引力的策略。
章节片段
材料
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基（聚乙二醇）-2000（DSPE-PEG 2000，#R-1028-2 K）、DBCO-硫缩酮（TK）-PEG 5000（# R-D526）和Cy5染料（#R-DP-176）购自西安瑞禧生物科技有限公司（#R-D526）。氮杂乙酰半乳糖胺-四酰化（Ac4GalNAz）购自Sigma Aldrich（#900915）。杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM）培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素购自Gibco-BRL（Grand
NT@ANX5-P纳米疫苗的设计与合成
为获得原位免疫纳米疫苗，我们设计并合成了一种具有聚集诱导发光（AIE）特性的新光敏剂（DNNT）以诱导细胞死亡，并构建了ANX5工程化细胞系作为递送组分以阻断免疫抑制性凋亡。DNNT分子的合成路线如图1A所示。在该分子中，二萘基苯胺被用作给体（D）单元，因为高度共轭的萘环预计能增强共轭以及
结论
综上所述，本研究提出了一种基因工程改造的、活性氧响应性的纳米疫苗，该疫苗将PDT诱导的肿瘤细胞损伤与PS依赖性濒死细胞清除的调节相协调。AIE光敏剂核产生用于PDT的活性氧以及用于硫缩酮-聚乙二醇切割的活性氧，在照射后增加了膜锚定ANX5的可及性。ANX5介导的PS屏蔽减少了巨噬细胞对濒死4T1细胞的摄取，伴随巨噬细胞重塑和增强的树突状细胞成熟，并有利于
CRediT作者贡献声明
王天娇：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，调查，资金获取，概念构思。王璐：方法论，调查，概念构思。康晓英：可视化，方法论，调查。姜俊燕：可视化，调查。袁宝辉：调查，形式化分析。张露：软件，调查。喻旭亚：验证，调查。陈婷：方法论，调查。李学平：调查，数据整理。张媛
致谢
本研究得到国家自然科学基金委员会（82572413和82203889）、中国医学科学院医学健康创新基金（2024-I2M-TS-027和2025-I2M-XHJC-046）、中国医学科学院非营利中央研究院基金（2025-JKCS-02）、中央高校基本科研业务费、北京协和医学院（3332024082）、天津市自然科学基金（25ZXZSSS00290）和国家重点实验室
王天娇|王璐|康晓英|江俊燕|袁宝辉|张露|喻旭亚|陈婷|李学平|张媛|孟雯|李健|齐纪|丁丹|石洋|李雯
