《Molecular Oncology》：Tumour-proximal deep serum proteomics identifies biomarkers associated with ovarian cancer
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卵巢癌的诊断常因缺乏明确的临床症状而延迟，凸显了对能够实现更早期检测的新型生物标志物的需求。使用质谱法（mass spectrometry, MS）在血液样本中进行蛋白质生物标志物发现具有分析挑战性，因为高丰度蛋白可能掩盖低丰度生物标志物的检测。研究人员从健康
卵巢癌的诊断常因缺乏明确的临床症状而延迟，凸显了对能够实现更早期检测的新型生物标志物的需求。使用质谱法（mass spectrometry, MS）在血液样本中进行蛋白质生物标志物发现具有分析挑战性，因为高丰度蛋白可能掩盖低丰度生物标志物的检测。研究人员从健康女性或患有良性或恶性（多数为I期）浆液性卵巢肿瘤的患者中收集了卵巢静脉（ovarian vein）和正中贵要静脉（median cubital vein，外周静脉）血清。在液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析之前，采用Proteograph XT检测作为蛋白质富集方法，以获得这些样本中更深的蛋白质组覆盖度。在初始的53份样本队列中，研究人员在所有样本中鉴定出6603种蛋白质，其中3467种蛋白质为卵巢血清所独有。排除红细胞污染样本后，差异丰度分析在卵巢和外周样本中分别鉴定了86种和101种与恶性肿瘤相关的候选蛋白。值得注意的是，ANK1、CAND1和GMPR2在两种样本类型中均存在差异丰度。使用逻辑回归结合重复交叉验证和置换检验，ANK1与临床CA125检测组合时表现出强大的区分性能[曲线下面积（area under the curve, AUC）= 0.97]。这些发现强调了卵巢静脉采样对于增强获取肿瘤相关蛋白的重要性，并支持进一步验证这些候选生物标志物用于卵巢癌早期检测。
卵巢癌是全球女性第八大常见癌症，每年新发病例超过32.4万例，死亡超过20.6万例。约90%的卵巢癌起源于上皮细胞，其中约70%为高级别浆液性卵巢癌。早期（I期和II期）卵巢癌经手术联合铂类化疗后5年生存率可达70%–95%，但晚期（III期和IV期）患者的生存率降至40%以下。遗憾的是，约75%的患者确诊时已是晚期，且不足20%的晚期患者能存活超过10年。早期诊断对于改善患者预后至关重要，但当前面临诸多困难：卵巢癌早期症状模糊且非特异（如腹胀、胃肠道不适和尿频），易与肠易激综合征等良性疾病混淆；临床广泛使用的癌症抗原125（cancer antigen 125，CA125）检测在早期阶段灵敏度低，且在许多良性病变（如子宫内膜异位症、盆腔炎）中也会升高；经阴道超声虽对卵巢肿块敏感，但对良恶性鉴别缺乏特异性。此外，基于CA125和超声的筛查并未显著降低无症状女性的卵巢癌死亡率。卵巢癌的分子遗传学背景复杂，涉及原癌基因激活和抑癌基因失活等多种突变，这些改变最终反映在蛋白质层面。因此，利用蛋白质组学技术深入解析血液中的肿瘤相关蛋白质，是寻找新型早期检测生物标志物的重要途径。然而，血液蛋白质组动态范围极大——22种高丰度蛋白占总蛋白含量的约99%，低丰度蛋白的检测受到严重遮蔽，需要有效的富集方法。近年来，基于纳米颗粒蛋白质冠富集的Proteograph XT检测可在质谱分析前压缩动态范围、提高低丰度蛋白检出率。在此基础上，研究人员采集肿瘤近端的卵巢静脉血和外周血，以期发现更贴近肿瘤生物学特征的生物标志物。
研究人员开展了一项纳入53份血清样本的深度蛋白质组学研究，样本来自健康女性及患有良性或恶性（多数为I期）浆液性卵巢肿瘤的患者，采集部位包括卵巢静脉和正中贵要静脉（外周静脉）。通过Proteograph XT检测的两种纳米颗粒（npA和npB）富集后进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，共鉴定出6603种蛋白质，其中3467种仅在卵巢血清中鉴定到。在排除红细胞污染样本后，差异丰度分析分别在卵巢和外周样本中鉴定出101种和86种恶性相关候选蛋白。其中ANK1、CAND1和GMPR2在两种样本类型中均呈一致性差异（在恶性病例中下调），ANK1与临床CA125联合使用时取得了最高的区分效能（AUC=0.97）。该研究凸显了卵巢静脉采样在获取肿瘤近端蛋白信号中的独特价值，为卵巢癌早期检测生物标志物的开发提供了候选列表和重要理论依据。
主要技术方法如下：样本来自澳大利亚皇家阿德莱德医院（RAH）的53份血清（2012–2020年采集）。研究人员采用Seer Proteograph XT检测的两种不同理化性质磁性纳米颗粒（npA和npB）进行血清蛋白冠富集；随后使用timsTOF Flex质谱仪上的dia-PASEF（数据非依赖采集-平行累积连续碎裂）模式进行LC–MS/MS分析。原始数据通过Spectronaut软件（v19）以无库（directDIA）模式搜索人类蛋白质数据库（UniProt，2023_05版），肽段和蛋白水平FDR设为1%。红细胞污染程度使用Baize软件评估，差异丰度通过FDR控制的非配对Student t检验（log2倍数变化阈值0.58，q<0.05）鉴定，候选蛋白需在至少80%样本中检出。随后使用MetaboAnalyst 6.0进行逻辑回归、重复交叉验证（100次）和置换检验（1000次）评估诊断性能。
3.1 来源于正中贵要静脉和卵巢静脉的血清样本蛋白质组学分析
通过Proteograph XT富集和LC–MS/MS分析，卵巢血清样本鉴定到的蛋白组数（>6400）显著高于外周血清（>3100）。主成分分析显示npA与npB数据集的蛋白谱存在差异，且两类样本（卵巢与外周）可区分。共6603个唯一蛋白中，3467个为卵巢血清独有，155个为外周血清独有。基因本体论分析显示，卵巢独有蛋白富集于mRNA加工、ATP合成/呼吸、外泌相关过程；外周独有蛋白富集于上皮细胞发育分化、纺锤体组装和细胞黏附。Baize软件标记出9个存在红细胞污染的样本（2个外周、7个卵巢），排除后卵巢和外周分别获得5558和3003个蛋白组，变异系数改善。此外，现有临床标志物MUC16（mucin-16，即CA125相关蛋白）和WFDC2（WAP four-disulfide core domain protein 2）仅在卵巢血清中被检出；其中MUC16在malignant样本（npB数据集）中丰度更高，且多个重复肽段与临床外周CA125水平呈正相关。
3.2 卵巢血清中良恶性之间的差异丰度蛋白
对无污染的卵巢血清（非恶性vs恶性）进行差异丰度分析：npA数据集中33个蛋白上调、46个下调；npB数据集中26个上调、44个下调。上调蛋白富集于染色质组织、巨核细胞分化和核小体组装，下调蛋白富集于Cajal体RNA/蛋白定位、端粒维持、肥大细胞趋化及肌动蛋白丝组织。经80%数据完整性过滤，共获得101个恶性相关候选蛋白。两个纳米颗粒数据集的候选重叠极小，仅有CCD80（coiled-coil domain containing 80）、FN3K（fructosamine-3-kinase）、HEM3（hydroxymethylbilane synthase）、RAC2（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2）和KPRB（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase associated protein 2）五个蛋白在两个数据集中均呈现一致差异，增强了其作为候选标志物的可信度。
3.3 外周血清中良恶性之间的差异丰度蛋白
外周血清的差异丰度分析显示，npA数据集中恶性样本有4个蛋白上调、81个下调；npB数据集中13个上调、55个下调。上调蛋白富集于核定位及凋亡信号负调控，下调蛋白富集于蛋白质稳定性和凋亡相关通路。经80%完整性过滤，共有86个候选蛋白。npA与npB的重叠候选为BDNF（brain-derived neurotrophic factor）、ITB3（integrin beta-3）、EPB41（erythrocyte membrane protein band 4.1）和ACTB（actin B），且变化方向一致。
3.4 ANK1、CAND1和GMPR2作为卵巢和外周样本中的恶性蛋白标志物
跨两类样本比较后，ANK1（ankyrin-1）、CAND1（cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1）和GMPR2（guanosine monophosphate reductase 2）在卵巢和外周血清中均为恶性相关候选，且均呈下调。三个蛋白在卵巢样本中的ROC曲线AUC均>0.8（ANK1、CAND1、GMPR2外周的AUC分别为0.839、0.762、0.778），准确率均>0.80。ANK1在外周血清中具有最高的AUC，提示其具有较好的区分良恶性潜力。
3.5 与临床CA125数据组合的恶性预测性能
在外周血清样本中，以逻辑回归结合重复交叉验证和置换检验评估单标记及组合模型。单独CA125的AUC为0.927，准确率0.849（P=0.003）；单独ANK1的AUC为0.779，CAND1为0.775，GMPR2无显著预测能力（AUC=0.618，P=0.279）。将CA125与ANK1联合后模型表现最佳，AUC=0.97，准确率0.91（P=0.004），优于单独CA125。其他组合未一致提高性能。由于样本量有限，模型置信区间较宽，AUC估计需谨慎解读。
讨论部分指出，卵巢静脉血清紧密贴近肿瘤，能反映肿瘤局部微环境信号，而外周血清更多体现宿主系统性反应。Proteograph XT显著加深了血清蛋白质组覆盖度，卵巢血清鉴定蛋白数接近外周的两倍。两个纳米颗粒产生的蛋白组特征不同、候选重叠小，但一致方向的重复结果增强了候选标志物的可信度。红细胞污染是一个重要干扰因素，需结合计算工具加以排除。MUC16和WFDC2仅在卵巢静脉检出，支持近端采样的必要性。ANK1、CAND1和GMPR2在多种癌症中的已有证据进一步支持其肿瘤生物学关联性，其中ANK1与CA125的组合最具临床应用潜力。但研究样本量小、缺乏独立验证队列，并且候选物未经正交方法验证，结果应视为探索性。
研究结论可翻译为：最终，使用Proteograph XT检测的深度血清蛋白质组学能够鉴定潜在的低丰度生物标志物。研究人员发现卵巢静脉血清富集了肿瘤近端循环蛋白，而这些蛋白在外周循环中被稀释至低于检测限。因此，在卵巢样本中观察到但未在外周样本中观察到的候选物不应被忽略，因为更敏感的检测方法如酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）可能辨别出显著差异。Proteograph与其他亲和检测（如SomaScan 11k和Olink Explore HT）的蛋白质鉴定重叠极少，这可能为分析这些蛋白质提供互补性。由于当前研究主要由I期卵巢肿瘤队列组成，未来工作可扩展至同时纳入局限性和转移性疾病患者的纵向设计，从而通过将基线分子特征与疾病进展及临床结局随时间的变化关联，实现更稳健的预后生物标志物鉴定。综上，这些发现揭示了组织近端与外周血清之间不同的蛋白质组学特征，加深了对采样位置如何影响生物标志物发现的理解，并支持未来开发用于卵巢癌诊断的血源性生物标志物。
