Cassia alata花提取物代谢物的液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS）谱图分析及其DPPH自由基清除活性研究

《Analytical Science Advances》：Liquid Chromatography Coupled With High-Resolution Mass Spectrometry Profiling of Metabolites in Cassia alata Flower Extracts and Their DPPH Free Radical Scavenging Activity

Cassia alata花相对于叶片而言，其植物化学成分仍未得到充分表征。然而，花组织可能含有独特且在某些物种中更为丰富的酚类和黄酮类化合物，代表了尚未开发的抗氧化植物化学物质来源，具有潜在的功能食品和营养保健品相关性。此外，Cassia alata L.（豆科，Fabaceae）是众多蒽醌类和黄酮类化合物的主要来源，但其花组织的次生代谢组与营养器官相比尚未得到深入研究。因此，本研究旨在检测C. alata花提取物的植物化学成分并评估其抗氧化潜力。据研究人员所知，这是首次采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC-HRMS/MS）和2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）对使用三种不同极性溶剂制备的C. alata花提取物进行比较分析。研究人员制备了C. alata花的水、70%甲醇和70%乙醇提取物，并在负离子模式下通过LC-HRMS进行表征。使用DPPH自由基清除试验测定抗氧化潜力。LC-HRMS初步鉴定了42种代谢物（在水、甲醇和乙醇提取物中），主要是黄酮类、酚酸类和糖苷类。一些值得注意的代谢物包括槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、异杨梅素苷（Isomyricitin）、山奈酚二己糖苷（Kaempferol-dihexoside）、山奈酚-O-芸香糖苷（Kaempferol-O-rutinoside）和槐花苷（Sophoricoside）。DPPH试验表明，所有提取物均表现出浓度依赖性的自由基清除活性。乙醇提取物表现出最强的活性，其IC₅₀值最低，为12.10 ± 2.22 μg/mL，其次是水提物，而甲醇提取物在植物提取物中活性最弱。乙醇提取物所表现出的抗氧化潜力可能与其初步鉴定的黄酮类相关代谢物的广泛多样性有关。这些结果表明，C. alata花提取物可能作为抗氧化植物化学物质的潜在来源，用于食品和健康相关应用。

Cassia alata L.（豆科，Fabaceae）是一种广泛分布于热带和亚热带地区的药用植物，传统上用于治疗皮肤感染、炎症、便秘及氧化应激相关疾病。尽管其叶片已被广泛研究，并报道含有酚类、黄酮类和蒽醌类等生物活性成分，但花组织的植物化学研究仍相对缺乏。花作为高度特化的植物组织，可积累独特的次生代谢产物，且在某些物种中，其酚类和黄酮类化合物含量可能超过营养器官。因此，本研究旨在利用液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS）技术对C. alata花的水、70%甲醇和70%乙醇提取物进行非靶向代谢物谱分析，并通过DPPH自由基清除试验评估其抗氧化活性。

研究人员从加纳纳夫龙戈（Navrongo）采集新鲜C. alata花，干燥后分别用水、70%甲醇和70%乙醇超声提取。采用超高效液相色谱（UHPLC）-Orbitrap高分辨质谱（HRMS）系统，在负离子模式下采集全扫描MS和MS/MS数据。代谢物注释通过SIRIUS、GNPS和PubChem数据库交叉验证，质量误差阈值设定为<5 ppm。抗氧化活性采用DPPH试验，计算半数抑制浓度（IC₅₀），并以抗坏血酸作为阳性对照。数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验进行统计比较，p<0.05视为差异显著。

3.1 LC-HRMS表征：通过数据库检索，共初步鉴定出42种代谢物，主要属于黄酮类、酚酸类和糖苷类。其中3种同时存在于水和70%甲醇提取物中，24种仅存在于70%甲醇提取物中，4种仅存在于70%乙醇提取物中，11种同时存在于70%甲醇和70%乙醇提取物中。典型化合物包括槲皮素、木犀草素、异杨梅素苷、山奈酚二己糖苷、山奈酚-O-芸香糖苷和槐花苷。这些化合物此前多在其他植物中报道具有抗氧化活性。此外，花中富含黄酮醇和黄酮的谱图与叶片中富含蒽醌的谱图形成对比，表明花具有独特的植物化学价值。

3.2 抗氧化活性：所有提取物均表现出浓度依赖性的DPPH自由基清除活性。70%乙醇提取物的IC₅₀值最低（12.10 ± 2.22 μg/mL），表明其抗氧化活性最强，其次是水提物（17.57 ± 2.51 μg/mL），而70%甲醇提取物的IC₅₀最高（71.37 ± 3.95 μg/mL），活性最弱。抗坏血酸的IC₅₀为5.94 ± 0.64 μg/mL。根据IC₅₀标准，70%乙醇和水提物表现出强抗氧化潜力，甲醇提取物为中等潜力。统计分析显示三种提取物之间存在显著差异（p < 0.05）。乙醇提取物的强活性可能与其含有较多低糖基化黄酮和苷元有关，而甲醇提取物尽管代谢物种类最多，但活性较弱，说明抗氧化活性取决于代谢物组成而非总数量。

讨论部分指出，黄酮类化合物的结构-活性关系可部分解释不同提取物活性的差异：3′,4′-二羟基（儿茶酚）B环以及C2=C3双键与4-氧代基团共轭是决定黄酮抗氧化活性的重要结构特征，槲皮素和木犀草素均具备这些特征，而O-糖基化会通过改变电子离域和羟基可及性降低自由基清除活性。研究还承认仅使用DPPH试验的局限性，未来应结合FRAP、ABTS等方法并测定总酚和总黄酮含量以进一步验证。该研究强调了提取溶剂选择对最大化生物活性的重要性。

结论：本研究首次提供了基于LC-Orbitrap-HRMS/MS、经多数据库验证的C. alata花代谢物谱，共初步鉴定42种代谢物，并评估了其抗氧化活性。其中70%乙醇提取物表现出最强的自由基清除能力，可归因于其丰富的生物活性成分（如异杨梅素苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚-O-芸香糖苷和槐花苷）。因此，C. alata花提取物可作为抗氧化植物化学物质的潜在来源，应用于功能食品和健康相关产品。