腹腔镜灌洗主要降低腹膜炎症蛋白水平并与机械冲洗一致：一项随机对照实验研究

《Journal of Surgical Research》：Laparoscopic Lavage Predominantly Reduces Peritoneal Inflammatory Proteins, Consistent With Washout

　　

引言：腹腔镜灌洗（laparoscopic lavage）是部分穿孔性憩室炎（perforated diverticulitis）和化脓性腹膜炎（purulent peritonitis）患者的治疗选择，但其作用机制仍不清楚。其效应主要由机械冲洗（mechanical washout）驱动还是由操作因素驱动仍未知。本实验研究旨在确定灌洗和操作因素对早期腹膜炎症反应的相对贡献。

方法：在一项随机、对照、实验研究中，124只大鼠接受假手术剖腹术（sham laparotomy）或盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）诱导的腹膜炎，随后接受预定义干预，改变灌洗、吹入气体（二氧化碳（CO₂）与氦气（helium））、灌洗液（盐水（saline）与缓冲液（buffered solution））以及腹内压（intra-abdominal pressure）（2与8 mmHg）。干预后1 h使用92种蛋白炎症检测组合（panel）分析腹膜液（peritoneal fluid）和血清（serum）。通过主成分分析（principal component analysis, PCA）评估蛋白组模式，并使用混合线性模型（mixed linear models）评估差异蛋白丰度。

结果：腹膜炎症蛋白谱在灌洗与非灌洗动物之间清楚分离，吹入气体、灌洗液或腹内压无一致效应。灌洗与腹膜液中炎症蛋白水平降低相关，包括细胞因子、趋化因子和生长因子信号蛋白，而仅少数蛋白增加。在血清中，实验组之间未观察到蛋白谱的相应分离。

结论：灌洗是腹膜炎症蛋白水平降低的主要贡献因素，操作因素无明确效应。这些发现最符合机械清除和稀释作为观察到的腹膜炎症蛋白水平降低的主要解释，并支持进一步研究灌洗体积作为临床环境中的潜在重要因素。

该研究由 Erik Sinclair、Lena ?hman、Koen Simons、Maria K. Magnusson、Mattias Prytz、Eva Haglind 等完成。研究背景方面，大肠憩室病在西方国家高度流行并随年龄增加，约30%个体在50岁时受累，65岁时可达50%；约1%-4%憩室病患者发展为憩室炎。憩室炎可从轻度自限性炎症进展为复杂疾病，最严重时发生穿孔并导致弥漫性化脓性或粪性腹膜炎，通常需要急诊手术。传统手术管理包括肠段切除；在化脓性腹膜炎中，若干随机对照试验评估了腹腔镜灌洗作为切除炎症和穿孔结肠段的替代方案。接受腹腔镜灌洗的患者住院时间更短、额外手术更少、12个月造口率更低，但灌洗与更高的术后感染并发症率相关。腹腔镜灌洗包括建立CO₂气腹，然后用大量盐水冲洗腹膜腔直至流出液清澈。此前实验模型已显示灌洗显著降低腹膜液中几种炎症蛋白浓度，但该反应反映机械清除、直接生物学效应还是二者组合仍不确定。若干操作因素可能影响腹膜炎症环境：CO₂作为标准吹入气体可能调节免疫反应，并在溶于冲洗液时导致短暂腹膜酸化；氦气提供不改变pH的惰性对照；等渗盐水在CO₂存在下预计酸化，而缓冲液如Physioneal设计用于维持稳定pH；腹内压也与免疫调节相关。因此，研究人员旨在表征腹腔镜灌洗对早期腹膜炎症反应的影响，并确定其主要由机械冲洗驱动，还是受吹入气体类型、灌洗液类型、腹内压或其特定组合影响；研究人员假设盐水溶解CO₂导致灌洗液酸化可能有助于灌洗后炎症介质衰减。

研究人员开展了一项随机、对照、实验研究。共124只Sprague–Dawley大鼠进入最终研究，其中110只接受CLP诱导腹膜炎，14只接受假手术剖腹术；腹膜炎动物分配至11个干预组，假手术动物分配至3个对照组。实验改变灌洗与否、吹入气体（CO₂或氦气）、灌洗液（盐水或Physioneal）、腹内压（2或8 mmHg）。干预后1 h采集腹膜液和血清。研究得出结论：灌洗是腹膜炎症蛋白水平降低的主要贡献因素，操作因素未显示一致效应，尽管适度因素特异性效应不能排除；这些发现最符合机械清除和稀释作为主要解释，并支持进一步研究灌洗体积作为临床潜在重要因素。

用于开展研究的主要关键技术方法可概括为：样本来源为Sprague–Dawley大鼠，购自Charles River Laboratories, Calco, Italy；采用CLP诱导化脓性腹膜炎或假手术剖腹术，8 h后按预设随机分组接受灌洗、CO₂或氦气、盐水或Physioneal、2或8 mmHg腹内压干预；干预后1 h采集腹膜液和血清；使用Olink Mouse Exploratory panel（92种蛋白）和Proximity Extension Assay技术测定归一化蛋白表达（normalized protein expression, NPX）；采用PCA、混合线性模型（含手术日期随机效应）、Kenward–Roger法、q-value估计阳性错误发现率（positive false discovery rate, pFDR）及似然比检验（likelihood ratio test, LRT）进行分析。

研究结果如下。灌洗后的蛋白组变异（Proteomic variation following lavage）：通过PCA分析，腹膜液蛋白表达谱在灌洗与未灌洗动物之间显示清晰分离；假手术动物形成独立聚类，并与所有腹膜炎组分离，符合腹膜炎具有独特炎症蛋白组谱；血清中实验腹膜炎组之间未观察到清晰分离，因此后续灌洗效应分析限于腹膜液。将残余灌洗体积映射至PCA坐标未观察到与主成分的梯度或关联。

灌洗后炎症蛋白水平广泛降低（Widespread reduction in inflammatory protein levels following lavage）：差异丰度分析聚焦灌洗与非灌洗腹膜炎动物，灌洗与腹膜液蛋白丰度广泛降低相关。关键炎症介质如C-C motif chemokine ligand 5（Ccl5）、C-X-C motif chemokine ligand 9（Cxcl9）、interleukin-1 beta（Il1b）和tumor necrosis factor（Tnf）降低，细胞粘附和生长因子信号相关蛋白如vascular endothelial growth factor D（Vegfd）、tenascin R（Tnr）和ADAM metallopeptidase domain 23（Adam23）也降低。66个名义P < 0.05的蛋白中，58个在灌洗后丰度降低；较小亚组蛋白灌洗后丰度升高，但无明确功能类别聚类。

治疗组合间残余异质性（Residual heterogeneity among treatment combinations）：对44个蛋白，包含个体治疗组合的模型比仅含灌洗状态的模型拟合更好（名义LRT P < 0.05），表明存在超出灌洗总体效应的残余异质性；但组特异估计未显示与吹入气体、灌洗液或腹内压相关的一致模式，尽管不能排除适度因素特异性效应。

讨论部分总结：在这项随机研究中，灌洗是腹膜炎症谱的主要影响因素，未识别出个体操作因素的一致模式；但治疗组合间残余异质性提示吹入气体类型、灌洗液类型或腹内压水平的适度效应不能排除。血清中未观察到灌洗对总体蛋白模式的清晰影响，可能反映干预与采样间隔较短，限制了系统炎症变化的检测。此前研究已证明腹腔镜灌洗降低腹膜液炎症蛋白水平，本研究通过系统评估灌洗的个体操作组成部分扩展了这些发现。灌洗后腹膜液蛋白水平广泛降低，影响细胞因子、趋化因子和粘附信号蛋白等多类炎症介质，最符合机械冲洗和稀释；但小亚组如lipoprotein lipase（Lpl）和nicotinamide adenine dinucleotide kinase（Nadk）灌洗后丰度增加，复制了此前实验研究发现，提示灌洗效应可能不完全由被动清除解释，不过NPX为相对测量，表观增加应谨慎解释。残余灌洗体积与样本分布无关，提示动物间保留液体体积变异不太可能解释组分离。总体而言，这些发现不支持研究人员关于CO₂和盐水组合在研究所条件下诱导额外调节效应的假设。灌洗使用相对大液体体积，30 mL/约300 g大鼠约相当于100 mL/kg，约为75 kg人类7.5 L；临床推荐灌洗体积在随机试验中差异较大（3-6 L），程序未严格标准化。高容量冲洗与阑尾切除术后包括穿孔病例的腹腔内感染率降低相关，提示进一步研究不同灌洗体积可能有意义。优势包括控制实验设计、临床相关灌洗体积和腹内压范围、随机化及纳入雌雄动物；局限包括未获得干预前样本、预定义炎症panel可能遗漏相关蛋白、小鼠panel用于大鼠样本、缺乏直接pH测量、探索性设计无正式功效计算、腹内压比较限于盐水灌洗组、单一早期采样时间点以及健康年轻大鼠限制普遍性等。

结论翻译：在这一化脓性腹膜炎实验模型中，腹腔镜灌洗是腹膜炎症蛋白水平降低的主要贡献因素。未识别出一致的因素特异性模式，尽管吹入气体类型、灌洗液类型或腹内压水平的适度效应不能排除。