斯洛伐克 Pinus sylvestris 林分中针叶真菌群落与 Dothistroma septosporum 的发生：物种特异性 qPCR 与 ITS2 metabarcoding 联合研究

《Ecology and Evolution》：Fungal Needle Communities and Dothistroma septosporum Occurrence in Pinus sylvestris Stands in Slovakia

由 Dothistroma septosporum 引起的 Dothistroma needle blight（DNB）是全球重要的松树病害，但其在本土寄主系统中的生态作用仍未完全阐明。研究人员将物种特异性定量PCR（quantitative PCR，qPCR）与 ITS2 metabarcoding 结合，调查斯洛伐克天然林分中 Pinus sylvestris 上 D. septosporum 的发生及与其相关的针叶 mycobiomes，并纳入一个混合的非天然阳性参考组（pooled non-natural positive-reference group）用于比较。D. septosporum 在 Vernár 天然林分中被检测到（16个样本中11个），该林分也观察到可见 DNB 症状；在非天然阳性参考组的全部样本中亦被检测到（15个样本中15个）。该病原菌在其他三个采样的天然林分中未被检测到。真菌群落分析显示样本组间群落组成存在显著差异，而 α 多样性模式变化相对较小。所有地点中最丰富的属为 Lophodermium，而 Dothistroma 仅在非天然阳性参考组中高度丰富。共现网络分析表明真菌群落以正关联为主；然而，涉及 Dothistroma 的模式主要反映阳性参考组，其中该病原菌高度丰富。结果表明，D. septosporum 并非斯洛伐克天然 P. sylvestris 林分针叶 mycobiomes 中可持续检测到的组分，且其在非天然阳性参考组中的高丰度与独特的真菌群落组成相关。

Dothistroma septosporum 引起的 Dothistroma needle blight（DNB）是松树全球性重要病害，可造成针叶坏死、提前落叶、生长下降，严重时树木死亡，并带来木材生产、景观、休闲和观赏价值损失。其全球分布促使研究人员关注其历史起源和本土范围；微卫星和交配型等分子标记促进了群体分析。中欧 D. septosporum 群体的起源存在不同结论，有证据支持欧洲起源，而 Mullett 等的大尺度分析支持欧亚起源，并提示东北欧和西亚可能是起源中心。东北欧群体遗传多样性最高，且位于 Pinus sylvestris（欧洲赤松）欧洲天然分布核心区；斯洛伐克与 P. sylvestris 相关的 D. septosporum 群体也显示高遗传多样性。病原可在无明显症状组织中存在，长期寄主—病原关联系统中尤其值得研究；但 D. septosporum 在早期侵染或无症状组织中检测困难。物种特异性 qPCR 具较高诊断准确性，而基于 ITS 区域的高通量测序宏条形码（metabarcoding）可揭示优势与稀有真菌类群。基于此，研究人员结合 qPCR 与 ITS2 metabarcoding，研究斯洛伐克天然 P. sylvestris 林分中 D. septosporum 的发生及针叶真菌群落组成，并纳入已由 qPCR 确认 D. septosporum 阳性的混合非天然阳性参考组。研究还评估样本组间真菌群落结构差异、真菌类群共现模式，并用分类分析识别与组间差异相关的真菌类群。假设为：若 D. septosporum 长期存在于这些生态系统，则可能在无症状林分中出现，且不伴随针叶 mycobiome 的重大转变；样本组在真菌群落结构和共现模式上不同，并存在可区分样本组的真菌类群子集。

关键技术方法：天然林分来自斯洛伐克 Spi? 地区，包括 Slovak Paradise National Park 的 Hrabu?ice、Vernár，以及 Hornád Basin 的 Dani?ovce、Spi?sky Hrhov；2022年5月采集落针，每林分13–16株，共57株天然样本。非天然阳性参考组来自2014–2019年7个非天然 P. sylvestris 林分的15个样本（针叶或DNA提取物），均已确认 D. septosporum 阳性；共72个DNA样本。方法包括物种特异性 qPCR 检测 D. septosporum，ITS2 metabarcoding（gITS7/ITS4，Illumina MiSeq），SEED2聚类为操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs），UNITE注释；在 MicrobiomeAnalyst 和 R 中进行 α、β 多样性、PERMANOVA、共现网络和随机森林（Random Forest，RF）分析。

结果部分：3.1 Presence of DNB Symptoms：视觉评估四个天然林分，仅 Vernár 观察到典型 DNB 症状，Hrabu?ice、Dani?ovce、Spi?sky Hrhov 未见可见症状。3.2 Molecular Detection of D. septosporum：qPCR 检测全部72个样本，Vernár 11/16（68.75%）阳性，非天然阳性参考组15/15（100%）阳性；其他三个天然林分均未检出。ITS metabarcoding 显示非天然阳性参考组中 Dothistroma 属相对丰度27.1%，Vernár 低于1%。3.3 Fungal Community Composition：ITS2 测序获得1,058,455条高质量无嵌合序列，平均每样本14,701条，共1676个 OTUs。多数样本组中 Leotiomycetes 占71.0%–84.8%，但非天然阳性参考组降至26.0%，其中 Dothideomycetes 最高为41.2%，Tremellomycetes 11.3%，Sordariomycetes 8.2%；Vernár 的 Dothideomycetes 为10.5%，Dani?ovce 8.3%，Hrabu?ice 3.6%。科水平上 Rhytismataceae 在各样本组最丰富，占26%–55%，非天然阳性参考组仅17.1%，而 Mycosphaerellaceae 占27.2%。属水平上 Lophodermium 最丰富，占17.2%–54.8%；Phacidium 在 Hrabu?ice 最高17.3%，其他地点1.0%–9.7%；Cyclaneusma 为2.5%–8.4%；Dothistroma 仅在非天然阳性参考组高丰度，为27.1%，Vernár 低于1%。3.4 Co-Occurrence Patterns of Fungal Genera：共现网络约30个节点、80条边，85%–90%为正关联，相关系数 r=0.52–0.76。Dothistroma 与 Genolevuria（r=0.755）、Alternaria（r=0.598）强正相关；Fusarium 与 Penicillium（r=0.722）正相关，酵母样类群 Sporobolomyces、Piskurozyma、Krasilnikovozyma 之间 r=0.54–0.69。负关联包括 Dothistroma 与 Lophodermium（r=?0.639）、Phacidium（r=?0.628），Extremus 与 Cyclaneusma（r=?0.556），Neocatenulostroma 与 Lachnellula（r=?0.530）。Dothistroma、Alternaria、Genolevuria、Fusarium、Penicillium 具较多显著关联。3.5 Alpha Diversity of Fungal Communities：Chao1、ACE、Shannon、Simpson 指数显示一致模式。Chao1 和 ACE（Kruskal–Wallis，p<0.001）显示 Spi?sky Hrhov 真菌丰富度最高，Dani?ovce 高但变异较大，Hrabu?ice 和非天然阳性参考组较低，Vernár 中等。Shannon 和 Simpson（p<0.001）显示多数样本组多样性高，Hrabu?ice 变异明显且部分样本多样性显著降低，非天然阳性参考组 Simpson 值稳定较高但丰富度较低。3.6 Beta Diversity Among Sample Groups：基于 Bray–Curtis 相异度的 β 多样性显示样本组间真菌群落组成显著不同（PERMANOVA：F=6.6739，R²=0.287，p=0.001）。Hrabu?ice 与非天然阳性参考组差异最强（R²=0.339，p=0.0017），Dani?ovce 与非天然阳性参考组亦差异较强（R²=0.313，p=0.0017）。其他显著比较包括 Hrabu?ice 与 Spi?sky Hrhov、Vernár，非天然阳性参考组与 Spi?sky Hrhov、Vernár，Dani?ovce 与 Vernár、Hrabu?ice；Dani?ovce 与 Spi?sky Hrhov 差异不显著（p=0.067），Spi?sky Hrhov 与 Vernár 虽显著（R²=0.063，p=0.031）但效应弱。3.7 Random Forest Classification of Fungal Communities：随机森林模型总体袋外（out-of-bag，OOB）错误率为0.111。非天然阳性参考组分类错误0.000，Hrabu?ice 0.0769，Vernár 0.125，Dani?ovce 0.143，Spi?sky Hrhov 0.214；误分类主要发生在天然林分之间。平均精度下降（Mean Decrease Accuracy，MDA）显示最重要特征为 Dothistroma OTU0004，其次为多个 Lophodermium OTUs、Neocatenulostroma OTUs，以及 Genolevuria OTU0070、Vishniacozyma OTU0024、Heterocephalacria OTU0023、Saxophila OTU0148。

讨论部分总结：4.1 分子检测表明，D. septosporum 仅在四个天然林分之一被检测到，且在 Vernár 高频检出并伴随典型症状，而在其他天然林分未检出；结果不支持该病原在斯洛伐克天然 P. sylvestris 林分中作为常见无症状或潜伏内生菌广泛存在。Vernár 靠近繁忙道路和人类定居点，且存在 P. nigra，可能利于病原发生，但人为与自然扩散贡献无法区分。4.2 真菌群落组成与多样性方面，ITS metabarcoding 显示样本组间 β 多样性显著不同，而 α 多样性普遍较高；天然林分主要由 Rhytismataceae 和 Lophodermium 主导，非天然阳性参考组则 Dothideomycetes、Mycosphaerellaceae 和 Dothistroma 更突出。差异主要体现为类群身份和相对丰度变化，而非总体多样性丧失。Hrabu?ice 保护程度高且无管理，形成独立聚类并与非天然阳性参考组差异最大；但管理、林分历史和局地环境效应无法分离。4.3 共现网络中正关联为主，Dothistroma 被整合进网络，其模式主要反映非天然阳性参考组；其与 Genolevuria、Alternaria 正相关，与 Lophodermium、Phacidium 负相关，但这些为统计相关，需实验验证。4.4 随机森林分类显示非天然阳性参考组可完全区分，天然林分间存在重叠；Dothistroma OTU0004 最具区分贡献，但多个 Lophodermium 和 Neocatenulostroma OTUs 亦有贡献。4.5 局限包括天然林分单季采样，非天然比较材料为多年、多地点存档且按阳性选择，因此林分类型、地点、采样时期、病原状态和样本历史不独立；天然样本为落针，受衰老后分解和二次定殖影响，不能完全代表活针 mycobiome。

研究结论部分翻译：本研究结合物种特异性 qPCR 和 ITS2 metabarcoding，评估了斯洛伐克 P. sylvestris 中 D. septosporum 的发生及其与针叶相关真菌群落的关系。该病原仅在一个具有可见症状的天然林分中被检测到，而在其他无症状天然林分中未检测到。相反，其在非天然阳性参考组中被一致检测到且高度丰富。这些发现不支持 D. septosporum 是该区域天然 Scots pine 生态系统针叶 mycobiomes 中常规隐秘组分的假设。高丰度见于混合非天然阳性参考组，而本研究设计不能将该模式具体归因于林分类型。天然林分真菌群落相对一致，并由典型针叶相关类群、Ascomycota 成员主导，其中 Lophodermium 在所有地点最丰富。非天然阳性参考组显示群落组成和结构的明显变化，包括 Dothideomycetes 和 Dothistroma 丰度增加。共现模式进一步表明潜在竞争和促进互作，提示 D. septosporum 的定殖和增殖可能受更广泛群落动态影响。总体而言，结果强调使用环境DNA（environmental DNA，eDNA）方法进行病原检测时需在生态背景下解释。靶向 qPCR 与群落水平 metabarcoding 的结合为检查病原发生及更广泛真菌群落提供了有用框架。但观察模式应考虑落针采样限制和比较材料非统一采样历史。未来对大量新鲜针叶、包括无症状组织，进行跨季节和地点的标准化采样，将有助于确定 D. septosporum 是否在无症状天然 Scots pine 林分中一致低丰度存在。针对多个基因组区域的互补物种特异性检测可进一步加强病原检测，并有助于区分病原相关效应与环境及采样相关变异。