《Environmental DNA》：Combining Morpho-Taxonomy and Metabarcoding Enhances the Detection of Biofouling Communities at Offshore Sites
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生物污损（biofouling）对离岸可再生能源（ORE）基础设施构成挑战。生物污损可降低能源效率、增加维护成本，并通过促进非本地物种（NIS）的建立而改变当地生物多样性。然而，由于离岸站点难以进入，且受分子与形态学方法局限性的影响，物种往往难以鉴定，离岸环境
生物污损（biofouling）对离岸可再生能源（ORE）基础设施构成挑战。生物污损可降低能源效率、增加维护成本，并通过促进非本地物种（NIS）的建立而改变当地生物多样性。然而，由于离岸站点难以进入，且受分子与形态学方法局限性的影响，物种往往难以鉴定，离岸环境中生物污损群落的结构与动态仍知之甚少。本研究结合形态分类学分析与DNA（COI和18S rRNA基因）分析，对位于大西洋和地中海四个近岸及离岸站点的生物污损群落进行了表征。研究人员改编并应用了一套整合分析框架，旨在改进物种鉴定、提升分类分辨率并最小化方法偏差。整合数据集共鉴定出465个分类单元，其中包括22个非本地物种（NIS），各方法间重叠有限，凸显了其互补性。宏条形码（metabarcoding）揭示了大量隐秘及微观分类单元，特别是微型真核生物（在18S rRNA检测到的分类单元中占比高达32%），而形态学分析则鉴定了大型生物，占整合数据的比例最高达25%。此外，本研究结果还表明空间和时间效应对群落组成存在影响。地理区域是群落的主要驱动因子，而离岸距离或浸没时间的影响则较为有限。值得注意的是，在大西洋各采样站点中，近岸站点的物种丰富度显著高于离岸站点。群落演替的特征是从多样化的先锋组合（端足类、水螅类）向以贻贝属（Mytilus）为主的成熟阶段过渡。多变量分析表明，生物污损群落结构受物理化学因素和时间因素影响，其次是水动力条件（作为解释变量纳入本分析框架）。本研究强调了将DNA分析与形态分类学整合对于提升生物污损多样性检测能力的重要性。
论文解读
一、研究背景与问题
在全球气候变化与能源需求日益增长的背景下，离岸可再生能源（ORE）基础设施（如风电基础、系泊系统和电缆）正大规模部署于海域中。这些长期浸没的人工结构不可避免地面临生物污损（biofouling）问题——即微生物膜、大型藻类及藤壶、贻贝、管虫等大型无脊椎动物对浸没表面的定殖。生物污损不仅会改变水动力特性、加速腐蚀、增加结构质量并损害敏感部件，从而降低能源效率并推高维护成本，还可能通过创造微生境、积累有机物而改变局部生物多样性，甚至促进非本地物种（NIS）的扩散。
然而，离岸环境中的生物污损群落结构及其动态至今仍缺乏充分认识。这一认知空白主要源于三方面原因：离岸区域可达性差、缺乏适应此类特殊环境的标准化方案，以及物种分类鉴定本身存在困难。传统形态分类学方法耗时费力、高度依赖分类学专家经验，且往往低估小型（小于1毫米）、隐秘或形态相近的物种。例如，离岸结构上常见的端足类Jassa herdmani与Jassa marmorata极易混淆，导致多样性估计失真。另一方面，eDNA宏条形码（metabarcoding）虽能检测更广泛的分类单元，包括稀有物种和微观阶段，但其半定量的特性无法直接量化物种丰度、生物量或生物体积，且结果高度依赖于DNA提取效率、引物选择、基因拷贝数及参考数据库的完整性与质量。
因此，将形态分类学与宏条形码方法相结合，有望更全面地刻画生物污损群落多样性，并提升对NIS等关注物种的检测能力。此前虽有研究在港湾环境中采用类似整合策略，但在离岸环境中探索两种方法整合如何增进对生物污损动态理解的报道仍十分有限。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在通过整合形态分类学与DNA数据，表征离岸地点生物污损群落的定殖动态，优化与人工基质相关的底栖群落物种检测与分类分辨率，并借助数值模型提供的环境数据，解析大西洋与地中海两种对比环境中驱动生物污损定殖过程的生态因子。
研究在四个站点部署了带有喷砂PVC板的浮标（浸没深度1.5米）：地中海海域的Cap Couronne（CAP，距岸2公里，近岸）与Leucate（LEU，距岸30公里，离岸），以及大西洋海域的Basse des Chats（BDC，距岸3公里，近岸）与Groix Belle-?le（GBI，距岸14公里，离岸）。每个站点在三个浸没时间点（3–6个月、1年、2年）各采集两块PVC板，分别进行分子分析（-20°C冷冻）与形态学分析（70%乙醇保存）。
研究得出的主要结论包括：整合数据集共鉴定出465个分类单元，其中22个为非本地物种（NIS），各方法间重叠有限，凸显了形态学与分子方法的互补性；宏条形码揭示了大量隐秘和微观分类单元（18S rRNA检测到的微型真核生物占比最高达32%），而形态学分析则鉴定了大型生物（占整合数据最高25%）；地理区域是群落组成的主要驱动因子，而离岸距离或浸没时间影响有限；在大西洋站点中，近岸站点的物种丰富度显著高于离岸站点；群落演替表现为从多样化的先锋组合（端足类、水螅类）向贻贝属（Mytilus）为主的成熟阶段过渡；物理化学因素和时间因素对群落结构的影响最大，其次是水动力条件。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：其一，形态分类学分析，对每块半板（300 cm2）上大于1毫米的标本进行鉴定与计数，群居物种（水螅类、苔藓虫类、部分藻类）仅记录有无，覆盖率通过目测估计，并使用世界海洋物种名录（WoRMS）的“Match Taxa”工具进行名称匹配；其二，宏条形码分析，使用DNeasy PowerBiofilm试剂盒提取DNA，扩增核18S rRNA基因V7区和线粒体COI基因，采用Illumina MiSeq平台（2×300 bp）测序，经DADA2降噪后使用FROGS流程进行分类分配（COI使用BOLD数据库，18S rRNA使用PR2数据库）；其三，整合分析框架，改编自Pereira等人（2021）的三步流程，包括DNA数据合并与地理过滤、DNA与形态学数据整合及丰度再分配（开发了RedistributeAbundances自定义R函数）、最终数据集的地理过滤排除；其四，环境变量提取，从哥白尼海洋环境监测服务（CMEMS）海洋模型中提取物理化学参数、水动力变量、生物组分和营养盐浓度，并使用基于距离的Moran特征向量图（dbMEM）生成时间变量；其五，统计分析方法，包括主坐标分析（PCoA）、双因素PERMANOVA、Mantel检验、基于距离的冗余分析（dbRDA）和方差划分。
四、研究结果
定量生物污损测量：生物量、生物体积和污损厚度总体上随浸没时间增加而增长，但各站点间存在差异。LEU站点生物量最高，24个月后约达85 kg/m2；12个月时LEU为53 kg/m2、CAP为6 kg/m2；大西洋站点中BDC（26 kg/m2）高于GBI（9 kg/m2）。污损厚度方面，LEU在24个月后接近100毫米，CAP约60毫米。这些定量结果与目视观察一致：LEU在12个月后出现密集贻贝覆盖，24个月时LEU和CAP均出现密集贻贝聚集体。
物种丰富度与β多样性模式：18S rRNA检测的物种丰富度最高（346种），其次为形态学鉴定（115种）和COI（85种）。分类分辨率方面，70%的形态学鉴定个体达到种级水平，而COI为52%、18S rRNA为53%。整合各方法后总物种数达494种，地理过滤后为465种。维恩图显示各方法间重叠有限，18S rRNA独有分类单元最多。β多样性分析（PCoA）显示所有方法均存在站点和浸没时间的显著效应（PERMANOVA，p=0.001），大西洋与地中海样本在所有数据集（除形态覆盖率数据外）中均清晰分离，但站点聚类模式因方法而异。整合数据集与18S rRNA数据的空间结构相似（Mantel检验相关系数0.97，p<0.001）。
生物污损组成的时空变异性：各站点的早期群落以端足类（Jassa属、Caprella属）和水螅类为主，12个月后贻贝在形态学数据中占优势，24个月时Mytilus edulis在地中海两个站点几乎构成整个群落。整合数据集显示，BDC站点群落异质性较高，包含端足类、藤壶、双壳类、多毛类和棘皮动物；GBI以J. marmorata为主；CAP和LEU在3–12个月由多种端足类主导，24个月后Mytilus edulis/galloprovincialis成为绝对优势种。
非本地物种鉴定：共鉴定出22个NIS。Mytilus edulis（在地中海被视为非本地种）、Jassa marmorata和Coryne eximia在所有站点和所有浸没时间均存在。红藻类（如Antithamnionella spirographidis）主要在BDC早期定殖阶段出现。部分物种（如Ectopleura crocea、Magallana gigas、Cephalothrix simula）在CAP和LEU的中间阶段（3–12个月）出现但24个月后消失。维恩图显示方法间NIS检测重叠极少，仅Mytilus edulis被三种方法同时检出；18S rRNA独有9个NIS分类单元，COI独有2种，形态学独有4种（包括Hydroides elegans、Magallana gigas、Antithamnionella ternifolia）。
环境与时间因素对群落的影响：dbRDA模型显著（p=0.001），解释总变异68.1%。CAP和LEU样本（尤其12和24个月）主要沿温度和洋流梯度排列，并与中尺度时间变量MEM2和MEM3相关；BDC和GBI样本则与营养盐、波浪作用和生物组分更相关。方差划分显示物理化学变量解释41%的变异，其次为时间参数（26.5%）、水动力（15.1%）、营养盐（9.3%）和生物组分（8.1%）。物理化学与时间参数的组合解释了高达42.5%的群落组成变异。
五、讨论总结
讨论部分指出，单一遗传标记不足以全面覆盖海洋生物污损的真核生物多样性——COI和18S rRNA仅共享6个共同物种，凸显了两者的互补性。18S rRNA可检测更广泛的真核生物（包括微型真核生物），但其序列保守性限制了后生动物的种级分辨率；COI则在后生动物中提供更精细的分类分辨率，但参考数据库覆盖不均导致46%的ASV在纲级无法分配（18S为14%）。形态学与宏条形码的重叠极少，形态学鉴定出76%的物种，而COI和18S rRNA分别仅为38%和36%。值得注意的是，贻贝（Mytilus spp.）在宏条形码分析中几乎完全缺失（24个月板上仅1%的18S序列），尽管形态学显示其覆盖率达100%，这归因于钙质外壳使裂解方法难以有效释放DNA。
整合框架的改进包括：将地理过滤器的部分功能前置用于验证和细化分类分配（而非排除），在丰度再分配前解决多归属序列的模糊性；修改丰度再分配函数，将分子检测记录为二元存在（值=1）以避免分子信息丢失；在再分配后重新应用地理过滤器作为排除步骤，在分类严谨性与生态敏感性之间取得平衡。
离岸站点表现出独特的时空多样性与组成，并趋向成熟组合。大西洋站点丰富度相对较高，近岸站点（BDC）在早期定殖阶段物种丰富度显著高于离岸站点（GBI），这可能与近岸更高的幼虫供应和更低的资源限制有关。地中海站点中，离岸的LEU在24个月后生物量和生物体积反而高于近岸的CAP，这一反直觉结果可能归因于较低的人为压力、更稳定的环境参数以及强发育能力的固着物种（如双壳类）的 dominance。群落演替从端足类（Caprella、Jassa）主导逐渐过渡到以大型固着滤食者（Mytilus edulis/galloprovincialis）为核心的结构，与北海离岸风电涡轮机上观察到的演替模式一致。
物理化学因素和时间因素是群落结构的主要驱动因子，其次为水动力条件。大西洋站点主要受波浪速度、初级生产和营养盐驱动，地中海站点则主要受温度、盐度和洋流影响。时间动态分析（dbMEM）表明，季节变化通过影响繁殖体可用性和底栖物种竞争力来驱动群落结构，物理化学与时间参数的组合解释了42.5%的变异。
六、研究结论
本研究通过整合形态分类学与DNA宏条形码方法，显著提升了离岸海域生物污损群落多样性的检测能力，共鉴定出465个分类单元（含22个非本地物种）。各方法的互补性得到了充分验证：宏条形码揭示了大量隐秘和微观分类单元，形态学则提供了可靠的丰度和生物量信息。地理区域是群落组成的主要驱动因子，物理化学因素和时间因素对群落结构的影响最为显著。群落演替呈现从多样化的先锋组合向贻贝主导的成熟阶段过渡的可预测模式。研究结果强调，将DNA分析与形态分类学整合对于提升生物污损多样性检测能力至关重要，这一整合策略为离岸可再生能源基础设施的环境管理和NIS监测提供了科学依据。
