《Environmental Microbiology Reports》：Bacillus tropicus and Bacillus safensis: A Potential Siderophore Producing Rhizospheric Bacteria: Its Characterisation and Optimisation
编辑推荐：
产铁载体根际细菌（Siderophore-Producing Rhizobacteria, SPR）已成为农业中植物保护和作物健康管理的一种可行策略。铁载体可将铁离子转运至细菌细胞内，供多种代谢过程使用，并在农业、医学、工业及环境领域具有应用价值。本研究从玉米
产铁载体根际细菌（Siderophore-Producing Rhizobacteria, SPR）已成为农业中植物保护和作物健康管理的一种可行策略。铁载体可将铁离子转运至细菌细胞内，供多种代谢过程使用，并在农业、医学、工业及环境领域具有应用价值。本研究从玉米田间土壤中分离并筛选了22株产铁载体细菌。其中7株细菌分离物呈现出明显的橙色晕圈，表明其具有产铁载体能力。然而，仅有两株强产铁载体菌株——Bacillus safensis（BMS—01）与Bacillus tropicus（BMS—15）——通过生理学特征及16S rDNA测序被进一步优化并鉴定。在以葡萄糖和蔗糖为碳源、NaNO?和(NH?)?NO?为氮源的条件下优化产铁载体能力后，研究人员发现Bacillus safensis（BMS—01）与Bacillus tropicus（BMS—15）在pH 8、28°C的理想条件下具有显著的铁载体产量（60%–70%单位）。研究结论表明，Bacillus safensis与Bacillus tropicus菌株展现出产铁载体的潜力，值得在未来的田间试验中进一步研究其作为生物防治剂和植物促生菌的应用前景。
论文解读：玉米根际产铁载体芽孢杆菌的分离、鉴定与发酵条件优化
一、研究背景与问题提出
铁是植物生长发育所必需的微量元素之一，在多种代谢过程中发挥关键作用。然而，在好氧环境中，游离态的三价铁离子（Fe(III)）极易形成不溶性的氢氧化物和羟基氧化物，导致土壤溶液中可利用铁浓度极低，严重限制了植物和微生物对铁的吸收。为应对这一铁缺乏困境，许多微生物进化出了一种高效的铁获取策略——合成并分泌一类低分子量的铁螯合化合物，即铁载体（siderophore）。铁载体能够与三价铁离子形成稳定的络合物，并通过细胞膜上的特异性受体将铁转运至细胞内，供微生物代谢利用。目前已发现的铁载体类生物分子约有500种，根据配体基团结构可分为羟肟酸型（hydroxamate）、儿茶酚型（catecholate）及混合羟基羧酸型等亚类。
铁载体不仅在微生物的铁代谢中发挥核心作用，其应用价值已拓展至多个领域。在农业系统中，产铁载体根际细菌（SPR）通过竞争性螯合根际铁离子，抑制植物病原微生物的生长，同时促进植物铁营养的获取，具有双重功能。此外，铁载体凭借其强大的金属螯合能力，可用于重金属污染环境的修复；在医学领域，铁载体可通过“特洛伊木马策略”与抗生素偶联，实现耐药菌的靶向递送，还可用于铁过载疾病（如镰状细胞贫血）的管理，并展现出抗疟、清除体内有毒锕系元素及潜在抗癌活性。尽管铁载体的应用前景广阔，但不同菌株的产铁载体能力受培养条件（如pH、温度、碳源、氮源、铁浓度及有机酸种类）影响显著，如何筛选高效产铁载体菌株并优化其发酵条件，是实现其农业应用的关键前提。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在从玉米根际土壤中分离高效产铁载体细菌，通过形态学、生物化学及分子生物学手段鉴定菌种，并系统优化产铁载体的培养条件，以评估其作为生物防治剂和植物促生菌的应用潜力。研究从玉米根际土壤样品中分离出22株细菌，经CAS检测（Chrome Azurol S法，一种基于染料变色原理定性定量检测铁载体的通用方法）筛选后，获得7株呈现橙色晕圈的阳性菌株，其中两株（BMS—01和BMS—15）表现出最强的产铁载体能力。经16S rDNA测序及系统发育分析，两株菌分别被鉴定为Bacillus safensis（GenBank登录号：OR136465）和Bacillus tropicus（GenBank登录号：OR136385），与已知模式菌株的同源性达99%。进一步通过单因素变量法（OVAT）对pH、温度、碳源、氮源、铁浓度及有机酸种类进行优化，确定了最佳产铁载体条件：pH 8、温度28°C、以葡萄糖/蔗糖为碳源、NaNO?/(NH?)?NO?为氮源、铁浓度25 μM、柠檬酸为有机酸。在此优化条件下，两株菌的铁载体产量可达60%–70%单位，显著高于未优化条件下的初始产量（BMS—01为27.80%，BMS—15为49.12%）。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：从玉米根际土壤采集样本（样本来源：印度博帕尔Barkatullah大学微生物学系玉米试验田根际土壤），通过梯度稀释涂布法在营养琼脂平板上分离纯化细菌；采用CAS琼脂平板法进行产铁载体菌株的定性初筛，并通过CAS液体定量检测法（630 nm波长下测定吸光度变化）计算铁载体产量百分比；通过革兰氏染色、MR-VP试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用、淀粉酶、氧化酶及过氧化氢酶等生化试验进行表型鉴定；利用16S rDNA基因扩增测序（约1200–1350 bp）结合NCBI BLAST同源比对及邻接法系统发育树构建（MEGA v.11.0软件，1000次自展检验）完成分子鉴定；采用单因素变量法（OVAT）对培养条件进行系统优化。
四、研究结果
3.1 产铁载体细菌的分离与筛选
从玉米根际土壤中分离获得22株细菌，经CAS琼脂平板法检测，其中7株出现橙色晕圈（铁载体阳性），最终筛选出两株产铁载体能力最强的菌株BMS—01和BMS—15。CAS检测的原理在于：当铁载体从CAS-HDTMA-铁复合物中夺取铁离子后，培养基颜色由蓝色逐渐转变为橙色，从而实现对产铁载体菌株的直观判定。
3.2 高效产铁载体菌株的鉴定
BMS—01和BMS—15经革兰氏染色均呈阳性，菌体为杆状，呈链状排列。生化试验结果表明，两株菌的MR、VP、淀粉酶和氧化酶试验均为阳性，吲哚和柠檬酸盐试验为阴性，过氧化氢酶试验BMS—01为阴性而BMS—15为阳性。16S rDNA测序结果显示，BMS—01与Bacillus safensis的序列一致性达99%（比对长度约1218 bp），BMS—15与Bacillus tropicus的序列一致性达99%（比对长度约1339 bp）。系统发育分析进一步确认了两株菌在Bacillus属内的进化位置。
3.3 产铁载体能力的定量评估
在未优化的中性pH和室温条件下，BMS—01和BMS—15的铁载体产量分别为27.80%和49.12%，定量确认了两株菌的产铁载体能力。研究指出，虽然CAS法可通用性地确认铁载体存在，但本研究未通过Arnow和Csaky试验进行特异性显色分类，原因在于传统功能基团特异性检测方法存在固有局限：铁载体的结构多样性远超经典儿茶酚型和羟肟酸型范畴，某些羧酸型或酚酸型铁载体（如根菌素、葡萄球菌铁载体）不与Arnow或Csaky试剂反应，易产生假阴性结果；且传统检测法的灵敏度阈值通常高于CAS法，低浓度样品可能无法检出；Csaky试验中的酸水解步骤还可能导致某些不稳定铁载体结构降解。因此，后续需借助液相色谱-质谱联用（LC–MS）或核磁共振（NMR）进行精确结构解析。
3.4 培养条件对产铁载体的影响
3.4.1 pH的影响：在pH 4–10范围内测试，两株菌在pH 8时铁载体产量最高。碱性条件下铁溶解度降低，刺激细菌合成更多铁载体以获取铁营养。
3.4.2 温度的影响：在28°C–45°C范围内，28°C为最适产铁载体温度，BMS—01和BMS—15在此温度下铁载体产量分别为35.48%和31.73%。
3.4.3 氮源的影响：在尿素、硝酸钠和硫酸铵三种氮源中，两株菌在硝酸钠和硫酸铵条件下产量接近（BMS—01约34.32%，BMS—15约37.82%），显著高于尿素处理组。
3.4.4 碳源的影响：在蔗糖、葡萄糖和果糖三种碳源中，蔗糖和葡萄糖均能显著促进两株菌的铁载体合成，而果糖处理组产量较低。
3.4.5 铁浓度的影响：在0–150 μM范围内测试，铁载体产量在25 μM时达到峰值，随后随铁浓度升高而下降。这一现象与Fur蛋白（铁摄取调节蛋白）介导的负反馈调控机制一致——当铁充足时，Fur蛋白与Fe2?结合抑制铁载体合成基因的转录。
3.4.6 有机酸的影响：在柠檬酸、乙酸和草酸三种有机酸中，柠檬酸显著促进铁载体产量提升，而乙酸和草酸效果有限。
五、讨论与结论
本研究成功从玉米根际土壤中分离并鉴定出两株高效产铁载体菌株Bacillus safensis（BMS—01）和Bacillus tropicus（BMS—15），并通过单因素变量法系统优化了其产铁载体条件。在pH 8、28°C、以葡萄糖和NaNO?分别作为最适碳源和氮源的铁限制条件下，两株菌的铁载体产量可达60%–70%单位，该结果经统计学检验（p < 0.05）确认具有显著性。CAS检测所反映的广谱铁螯合活性表明，这两株菌在铁缺乏土壤中具有作为生物防治剂的应用潜力。本研究为铁载体体外合成条件的优化提供了基础数据，进一步支持了Bacillus属菌株作为化学肥料环境友好型替代品的可行性。未来研究应聚焦于温室试验评估其植物促生和拮抗效果，并利用LC–MS等技术对铁载体进行精确结构解析，以充分挖掘其在规模化农业中的应用价值。
