《Ecology and Evolution》：Optimizing Marine eDNA Protocols for Rare Megafauna: A Case Study on Dugongs in the Western Indian Ocean
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评估栖息地利用、空间分布和位点忠诚度对于保护受威胁海洋物种至关重要，然而在复杂环境中监测稀有和难以捉摸的物种仍然困难重重。这一局限性对西印度洋的儒艮（Dugong dugon）种群尤为关键，该种群极其微小、破碎化且难以监测，构成了重大的保护挑战。本项预研究旨在
评估栖息地利用、空间分布和位点忠诚度对于保护受威胁海洋物种至关重要，然而在复杂环境中监测稀有和难以捉摸的物种仍然困难重重。这一局限性对西印度洋的儒艮（Dugong dugon）种群尤为关键，该种群极其微小、破碎化且难以监测，构成了重大的保护挑战。本项预研究旨在开发一种基于物种特异性定量聚合酶链式反应（qPCR）的成本效益高且现场优化的环境DNA（eDNA）工作流程，用于对该区域濒危海牛目动物在浅热带沿海生态系统中的大规模监测。野外采样在莫桑比克进行，该地拥有该区域唯一现存的大型儒艮种群。利用为本研究独立开发和验证的物种特异性qPCR测定法，研究人员评估了采样设计和样品处理如何在自然条件下影响儒艮eDNA检测。采样沿调查航线进行，采用不同的采样和DNA提取策略，以评估检测方案的三个关键变量：（i）垂直采样位置（表层、近底层和沉积物），（ii）过滤体积（1.5、30和60升），以及（iii）现场与实验室DNA提取，共产生11种采样-提取策略。在每个目视确认的地点，至少有一种采样-提取策略产生了阳性检测结果，包括在最后一次目击后长达2小时。所有策略均检测到儒艮DNA，但基于沉积物采样的策略除外。qPCR检测受到过滤体积与垂直采样位置之间交互作用的影响：在低过滤体积（1.5升）下，近底层的检测率高于表层，而这种差异在60升时消失。相反，增加过滤体积提高了表层的检测率，但对近底层影响甚微。实验室提取的性能明显优于现场提取。产生最高检测率的采样策略——大体积近底层过滤后接实验室样品处理——在所有发生目击事件的案例中均检测到了儒艮DNA。总体而言，这些结果表明过滤体积可以在一定程度上补偿与垂直采样位置相关的检测差异，并为基于eDNA的儒艮监测提供了一个稳健且适用于现场的框架，支持在热带沿海生态系统中开展可扩展和长期的监测工作。
研究背景、问题与研究意义
环境DNA（eDNA）方法革新了水生生物多样性监测，能够非侵入性地检测物种在数小时至数天生态时间尺度上的存在。该方法尤其适用于传统调查方法难以监测的稀有和难以捉摸的物种。然而，在海洋环境中，eDNA的持久性和检测受到微生物降解、物理化学胁迫以及稀释作用的限制，特别是在热带强紫外线条件下，DNA快速降解构成挑战。因此，进行预研究以评估协议性能并在大规模部署前验证概念可行性被视为关键步骤。
儒艮（Dugong dugon）是一种大型草食性海洋哺乳动物，保护状况堪忧，其种群在其整个分布范围内急剧下降。在西印度洋（WIO），儒艮以小而孤立的种群存在，其中最大的亚群位于莫桑比克的巴扎鲁托群岛。监测这些种群尤为紧迫，因为它们往往只有少数个体，极易灭绝，同时又是该区域物种保护的关键单位。传统的基于目视或航空调查的方法受限于该物种的低密度、独居和隐秘行为以及对人类活动的回避。
本研究旨在开发一种优化的eDNA方案，用于监测热带海洋环境中儒艮的存在，特别关注适用于大规模部署的野外采样和样品处理策略。研究工作被构想为一项预研究，旨在评估分子检测上游的方法学选择如何影响在自然条件下稀有儒艮eDNA信号的回收。具体评估内容包括：（1）垂直采样位置与底栖基质；（2）过滤体积；（3）样品处理方式（现场与实验室）。研究假设近底层水体由于与儒艮摄食活动相关，eDNA浓度更高，从而获得更高的检测率；更大的过滤体积能提高捕获稀有eDNA分子的概率；现场兼容的提取方案能提供与实验室处理相当的DNA回收率和检测性能。
关键技术方法
研究人员在2024年10月于莫桑比克巴扎鲁托群岛国家公园（BANP）内已知儒艮高频活动区进行了12次非线性船载调查航线。沿每条航线，采用了不同采样方法，包括不同体积的表层水过滤（1.5升和60升）、不同体积的近底层水过滤（1.5升、30升和60升）以及沉积物采集。样品分别进行现场和实验室两种方式的DNA提取。研究人员独立开发并验证了一种针对儒艮线粒体16S核糖体RNA（rRNA）基因的物种特异性定量聚合酶链式反应（qPCR）测定法（命名为Ddug01），用于检测目标DNA。数据分析采用广义线性混合效应模型（GLMM），将qPCR检测结果（八个技术重复中的阳性数）作为贝塔-二项响应变量，评估过滤体积、垂直采样位置和样品处理方式的影响及其交互作用。
研究结果
3.1 特异性qPCR测定法的开发
研究人员成功设计了一个名为Ddug01的引物-探针系统，可扩增儒艮16S rRNA基因上一个115碱基对（bp）的片段。计算机模拟分析显示其扩增仅限于儒艮和已灭绝的斯特拉海牛，证实了该测定法的高度靶标特异性。实验验证表明，从未稀释DNA到10-4稀释度均呈现一致的扩增响应，斜率为-4.819，决定系数（R2）为0.984，对应扩增效率为61.3%。10-4稀释度（相当于每反应0.944皮克DNA）在所有四个重复中均被一致检测到，被确定为检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
3.2 野外观察与eDNA检测
气象条件普遍良好，有利于长距离目视观察。在12条调查航线中，有9条在采样前2小时内目视观察到儒艮。qPCR检测结果显示，使用实验室协议处理的样品检测率显著高于现场协议处理的样品。研究发现过滤体积与垂直采样位置之间存在显著的交互作用。在1.5升过滤体积下，近底层采样显著提高了qPCR检测率，其比值比（OR）为5.81，约为表层采样的5.8倍。而在60升体积下，两个垂直位置之间无显著差异。相反，在表层，将过滤体积从1.5升增加到60升显著提高了检测率（OR=5.49），但在近底层则无此效果。这表明低检测率主要与1.5升的表层采样相关，而60升时两个位置的检测率相似。总体而言，儒艮DNA在35%的样品中被检测到，但各采样-提取策略间的检测率高度异质。所有水基采样策略均有阳性检出，但沉积物采样无一阳性。产生最高检测率的策略是大体积近底层过滤结合实验室DNA提取，在11份样品中有9份呈阳性。儒艮DNA在最后一次目击后1小时40分钟和2小时收集的样品中也被检测到，并且在未直接目视到儒艮的地点也有阳性检出。
讨论与结论总结
讨论部分指出，研究结果证明了基于eDNA的方法成功地在自然环境中检测到了儒艮。采用最优策略时，在所有目视观察到儒艮的地点（直至采样前约2小时）均检测到了其DNA。此外，在未直接观察到儒艮的地点也获得了阳性eDNA检测，这凸显了eDNA与目视调查提供的互补时空信息，但也需谨慎解读eDNA信号的精确来源。阳性检测可能反映未被目视发现的当地存在，或eDNA在动物经过后局部持续存在。在本研究中，儒艮eDNA在最后一次目击后约2小时仍可检测到。另一种可能是阳性检测源于邻近区域释放的eDNA随后被潮汐流输送至采样点。阴性结果的解读不仅取决于采样和处理工作流程的敏感性，还取决于影响局部eDNA可用性的环境条件。
关于采样-提取策略如何影响eDNA产量，讨论认为过滤体积和垂直采样位置不能独立考虑。在低过滤体积下，近底层检测率显著高于表层，而在60升时这种垂直差异消失。这表明增加采样水体积可以部分补偿表层水体中较低的eDNA可用性，而小体积样品对精细尺度的垂直异质性更为敏感。大体积过滤可能整合更大空间范围内的eDNA信号，从而降低对斑块状分布的敏感性。沉积物样品中未检出儒艮DNA，这可能反映了基质本身eDNA可用性较低、基质特异性的提取局限性，或两者兼有，但并不能证明沉积物本质上不适合儒艮eDNA检测。
关于现场友好型策略是否会损害eDNA性能，讨论认为不同的采样-提取策略在检测灵敏度和操作可行性之间存在权衡。大体积过滤结合正压泵在操作上是可行的，平均过滤速度为25秒/升，且不易堵塞。现场提取样品的性能显著低于实验室提取样品，这归因于现场离心力有限（最大5000g）以及无法处理大量保存缓冲液等技术限制，导致可回收DNA量减少。
研究结论总结如下：研究结果证明了基于eDNA的儒艮检测的可行性，并表明采样体积和垂直位置共同影响检测性能。在低过滤体积下，近底层采样显著提高了检测率，而增加过滤体积改善了表层检测率并基本消除了垂直位置间的差异。因此，对于大规模儒艮监测，研究结果支持将移动式表层采样与大体积过滤相结合作为一种实用方法，在检测性能和操作可扩展性之间提供了有利的折衷方案。特别是，表层采样不需要潜水员或额外水下设备，大大减少了大规模调查的后勤需求。当大体积过滤不可行时，针对近底层水体采样可能有助于提高检测性能，尤其是对于低体积采样，尽管这种方法涉及更大的后勤约束。鉴于本概念验证研究中采样事件和阳性检测数量有限，未来需要在更广泛的空间、时间和水动力条件下（特别是跨越潮汐周期）扩展采样努力，以确定调查时机是否能提高检测概率，更好地表征儒艮eDNA所代表的时空窗口，并评估所提出采样框架的普遍适用性。最终，这种方法可以促进将eDNA整合到针对小型和难以观测的儒艮种群的监测项目中，特别是在传统调查仍然具有挑战性的广阔热带沿海栖息地。
