《Journal of Virus Eradication》：Establishment and Performance Evaluation of Quadruplex RT-qPCR Method for Universal Avian Influenza Virus Detection and H5/H7/H9 Subtyping
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禽流感病毒（avian influenza viruses, AIVs）是人兽共患病原体，在全球呈周期性流行，构成显著公共卫生风险。该研究建立了一种四重RT-qPCR（quadruplex RT-qPCR）方法，靶向M基因用于通用AIV检测，并靶向HA基因用于
禽流感病毒（avian influenza viruses, AIVs）是人兽共患病原体，在全球呈周期性流行，构成显著公共卫生风险。该研究建立了一种四重RT-qPCR（quadruplex RT-qPCR）方法，靶向M基因用于通用AIV检测，并靶向HA基因用于同时区分H5、H7和H9亚型。该方法对基于HA基因定量的H5、H7和H9参考物质达到1 copy/μL的检测限，相当于每反应5 copies。对一组常见禽类病原体未观察到交叉反应。重复性评价显示批内和批间变异系数（coefficients of variation, CVs）均小于5%。此外，该方法对受试参考物质的结果与预期结果一致，环境样本的亚型分型结果与全基因组测序一致。这些发现表明，四重RT-qPCR方法是一种可靠的AIV广谱检测和H5/H7/H9亚型分型工具，支持其用于AIV监测。
禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）是人兽共患病原体，宿主范围包括家禽和野鸟，也可感染猪、马、猫、犬等哺乳动物，并有人感染分离报道。AIV基因组由8个单股负链RNA节段组成，包膜含血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）两种主要表面糖蛋白，依抗原性分为16种HA和9种NA亚型。节段化基因组及HA/NA高变异性促进亚型间重配和持续抗原变异，增加新型AIV出现及动物传人、人传人风险。根据对鸡的致病性，AIV分为高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV）和低致病性禽流感病毒（low pathogenic avian influenza virus, LPAIV），迄今所有HPAIV均属H5或H7亚型。1997年香港H5N1 HPAIV由鸡传人，造成18例感染和6例死亡；2024年美国奶牛发生H5N1 clade 2.3.4.4b暴发，并确认暴露者人感染。H7 HPAIV亦有人感染，2013年中国东部新型重配H7N9导致609人死亡。H9 LPAIV是家禽中最广泛、最常分离的AIV亚型，在全球养殖场和活禽市场呈地方性流行，1999年和2003年香港人感染呈轻度季节性流感样症状且无死亡；其轻症易被低估或忽视，可能促进在人群中逐步适应并与人类流感病毒重配。近年还报道了H3N8等其他AIV亚型人感染。因此，加强AIV监测至关重要，快速检测和分型对监测与感染控制不可或缺。
目前AIV诊断方法各有局限：鸡胚病毒分离是参考标准，但耗时长、劳动强度高，HPAIV需高生物安全级别实验室；血凝抑制（hemagglutination inhibition, HI）试验虽广泛用于亚型分型，但低病毒浓度下敏感性不足，可能漏检新型或抗原变异株并造成假阴性；RT-PCR和实时荧光定量逆转录PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）等分子方法快速、敏感、高效，已成为AIV准确检测和分型的首选。基于TaqMan?的RT-qPCR敏感性和特异性高，可在单反应中可靠检测多靶标，适合大规模监测中的同步分型。已有RT-qPCR方法多用于AIV检测或对H5、H7、H9中一个或多个亚型分型，但多数缺乏在单反应中同时检测并区分全部三个亚型的能力。为此，研究人员建立了TaqMan?四重RT-qPCR（quadruplex RT-qPCR）方法，靶向M基因通用检测所有AIV亚型（H1–H16），靶向HA基因同时区分H5、H7和H9亚型，为AIV监测和检测提供简化和快速工具。
研究人员开展的关键技术方法概述如下：研究人员使用H5、H7、H9 AIV亚型核酸参考物质，由灭活病毒培养物制备、经数字PCR（digital PCR）基于HA基因定量，来自CasMed Biopharma (Beijing) Inc.；H5N1、H7N9、H3N2灭活株由中国疾病预防控制中心提供，H3N8和H9N2由河北重点实验室保存；九种异源禽病原体来自河北动物疫病预防控制中心。环境样本队列为2021—2023年河北采集的6302份环境样本。关键技术包括核酸提取、M和H5/H7/H9 HA基因引物探针设计与EpiFlu?/GISAID序列匹配、四重RT-qPCR条件优化、特异性、重复性、参考样本一致性及环境样本检测，阳性样本经全基因组测序/下一代测序（next-generation sequencing, NGS）验证。
3.1 灵敏度导向的反应条件优化：以10 copies/μL和1 copy/μL参考物质为模板，优化引物、探针体积和退火温度。最终25 μL反应体系在50°C逆转录15 min、95°C初始变性10 min，随后5个预扩增循环和45个扩增循环，采用95°C 3 s、55°C 30 s两步方案，并在最终45个循环采集荧光。四靶标在10 copies/μL和1 copy/μL均同时检出，1 copy/μL重复检测为100%检出；基于HA基因定量，H5、H7、H9参考物质检测限为1 copy/μL，相当于每反应5 copies。Cy5荧光由M基因产生，FAM、Texas Red和VIC信号分别由H5、H7、H9 HA基因产生。
3.2 四重RT-qPCR方法的特异性：以九种异源禽病原体评价交叉反应，H5、H7、H9参考物质仅在各自检测通道产生阳性信号，九种异源病原体及无模板对照在四个通道均未扩增，表明该方法特异性满意。
3.3 四重RT-qPCR方法的重复性：使用H5、H7、H9参考物质在500、50、5 copies/μL浓度下各10重复，批内和批间均100%检出。批内变异系数（coefficient of variation, CV）为0.39%–1.84%，批间CV为0.94%–3.67%，均低于5%，显示高重复性。
3.4 方法参考样本的一致性：对7份阳性参考样本和1份阴性参考样本检测，单亚型株在各自亚型通道识别，混合亚型株在相应双通道识别，H3N2和H3N8仅在M基因通道检出，阴性样本四通道均阴性；全部8份参考样本均正确识别，与预期一致。
3.5 河北环境样本中的AIV检测：将该方法用于2021—2023年河北6302份环境样本筛查，16份M基因阳性，其中10份H5阳性、3份H7阳性、2份H9阳性、1份仅M阳性。NGS显示所有H5阳性样本含H5亚型AIV，或单感染或与其他亚型混合；除1份H7阳性样本（Ct=36.78）未获得NGS结果外，其余H7和H9阳性样本分型结果与NGS完全一致；仅M阳性样本鉴定为H3N3。结果表明该方法可检测AIV并同时区分H5、H7、H9亚型。
讨论部分指出，AIV作为全球关注的人兽共患病原体，持续威胁公共卫生和经济稳定，早期精准检测对有效疾病管理、及时防控、减少暴发和经济损失至关重要。现有病毒分离耗时且需高生物安全条件；抗原检测不能分型；血清学主要提示既往暴露而非活动感染，不适合早期诊断；RT-qPCR因高敏感、高特异和可分型成为AIV监测主要手段。多数已报道RT-qPCR不能在同一反应同时检测并区分H5/H7/H9三个亚型。该研究四重RT-qPCR靶向M基因通用检测H1–H16，并以HA基因分型H5/H7/H9。讨论强调，使用数字PCR定量的灭活病毒培养参考物质，经历核酸提取到扩增全流程，较质粒对照更能代表临床样本，避免质粒未经历提取和逆转录、环状DNA拷贝数计算偏差等局限。该研究采用目标驱动策略，预设1 copy/μL并据此优化，经10重复验证，检测限较既往研究低5–10倍。由于参考物质仅对HA基因定量，M与HA基因拷贝比不固定且可随病毒复制阶段变化，因此1 copy/μL检测限特指H5、H7、H9 HA基因；M基因因绝对拷贝数不能确定未纳入CV分析。一致性评价涵盖单亚型、混合亚型、H3N2和H3N8，结果均与预期一致；6302份河北环境样本筛查中，分型范围内阳性样本与全基因组测序完全一致，并发现混合感染及H5/H7/H9以外的H3N3，显示通用M基因靶标用于新型AIV监测的价值。
研究结论翻译：总之，该研究建立的四重RT-qPCR方法可在单一反应中同时检测所有AIV亚型，并区分H5、H7和H9亚型，检测限为1 copy/μL。该方法具有高分析特异性和重复性，环境样本亚型分型结果与全基因组测序完全一致。这些发现表明，该方法可靠且实用，可作为AIV早期检测和常规监测工具。
