髓系细胞酸性神经酰胺酶（AC）缺失对IL10缺陷小鼠慢性结肠炎的保护作用

《The FASEB Journal》：Loss of Acid Ceramidase in Myeloid Cells Protects From Chronic Colitis in IL10-Deficient Mice

　　

炎症性肠病（IBD）患者表现出酸性神经酰胺酶（AC）表达升高，该酶是鞘脂代谢中的一个关键酶。近期研究表明，髓系细胞是AC表达升高的主要来源之一，因此在这些细胞中条件性敲除AC可对急性结肠炎起到保护作用。研究人员将条件性ASAH1 LyzM-Cre敲除小鼠与IL10敲除小鼠杂交，以确定AC在自发性慢性结肠炎模型中的作用。研究人员对结肠组织进行了脂质、mRNA和蛋白质分析，并采用流式细胞术确定髓系AC在疾病免疫细胞募集中的作用。本研究发现，髓系细胞中AC的条件性缺失可保护小鼠免受慢性结肠炎，降低炎症标志物，增加结肠中神经酰胺含量，并减少炎症代谢物1-磷酸鞘氨醇（S1P）。肠道组织中的免疫细胞募集显著受损，特别是中性粒细胞以及效应性Th1/Th17 T细胞的募集。本研究结果表明，AC可能通过调节免疫细胞中的鞘脂代谢，成为炎症性肠病一个有前景的治疗靶点。

论文解读：髓系细胞酸性神经酰胺酶缺失通过调控鞘脂代谢与免疫细胞募集缓解IL10缺陷小鼠慢性结肠炎

一、研究背景与科学问题

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一类以慢性、非缓解性肠道炎症为特征的疾病，主要包括克罗恩病（Crohn's disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）。近年数据显示，IBD影响约1.3%的成年人，患病率较本世纪初增长约一倍，且儿童诊断比例不断上升。IBD患者发生结肠炎相关结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer, CAC）的风险为普通人群的4至10倍，疾病相关死亡率亦升高1.7倍。尽管IBD的病因尚未完全阐明，但饮食、肠道菌群、环境因素、肠道感染及免疫细胞浸润均参与疾病的发生与严重程度。其中，肠道耐受性微环境的破坏是疾病核心特征之一，巨噬细胞、树突状细胞和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）通过分泌抗炎细胞因子（如IL10和TGFβ）维持肠道免疫稳态；这些功能受损或获得促炎表型时，可驱动先天性和适应性免疫细胞的募集与活化，特别是中性粒细胞和效应性Th1/Th17细胞。

鞘脂是具有广泛生物学功能的活性脂质，其代谢中间产物神经酰胺（ceramide）被视为鞘脂代谢的枢纽。神经酰胺可被神经酰胺酶去酰化生成鞘氨醇（sphingosine），后者经鞘氨醇激酶（sphingosine kinases, SKs）磷酸化生成1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）。S1P通过激活G蛋白偶联受体S1PRs参与细胞增殖、迁移、血管生成及免疫细胞运输。多种鞘脂代谢酶已被证实在肠道炎症中发挥作用，如全身性SK1缺失对小鼠结肠炎具有保护作用，而碱性神经酰胺酶3或中性神经酰胺酶缺失则加重结肠炎。然而，既往研究多聚焦于T细胞中的鞘脂代谢，对髓系细胞中鞘脂如何参与IBD发病的认识尚存在明显空白。

酸性神经酰胺酶（acid ceramidase, AC）是一种溶酶体酶，可将神经酰胺水解为鞘氨醇和脂肪酸。AC在IBD患者的结肠黏膜巨噬细胞及小鼠DSS结肠炎的Mac-3+巨噬细胞中高表达。研究人员前期工作表明，在表达LyzM的髓系细胞中条件性敲除AC（ACΔMYE）可保护小鼠免受DSS诱导的急性结肠炎，并减少AOM/DSS诱导的CAC肿瘤负荷。然而，DSS模型是化学损伤驱动的急性模型，髓系AC是否参与慢性、免疫介导的结肠炎仍属未知。为此，本研究利用IL10缺陷（IL10?/?）小鼠——一种自发慢性结肠炎模型，系统探究髓系AC在慢性结肠炎中的病理作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员将AC条件性敲除小鼠与IL10缺陷小鼠（B6.129P2-Il10tm1Cgn/J）杂交，获得ACfl/flIL10?/?和ACΔMYEIL10?/?小鼠，并在8周和24周龄时对雄性和雌性同窝小鼠进行表型分析。主要技术方法包括：实时定量RT-PCR检测结肠组织炎症相关基因表达；ELISA检测IL1β和CCL5蛋白水平；组织学染色（H&E）由盲法兽医病理学家评估结肠炎症评分，免疫组织化学检测COX2、Ki67、cleaved caspase-3和pSTAT3表达；FITC-葡聚糖 permeability实验评估肠道通透性；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对结肠组织鞘脂进行脂质组学分析（数据标准化至总脂质磷酸盐Pi）；流式细胞术分析脾脏、外周血、结肠固有层（lamina propria, LP）和上皮内（intra-epithelial cell, IEC）区域的免疫细胞亚群。所有动物实验经亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会批准。

三、主要研究结果

3.1 髓系AC缺失减轻IL10?/?慢性结肠炎炎症

研究人员发现，ACfl/flIL10?/?与ACΔMYEIL10?/?小鼠的体重随时间变化无显著差异，但ACfl/flIL10?/?小鼠在24周龄时体重显著低于ACfl/flIL10+/+小鼠，而ACΔMYEIL10?/?与ACΔMYEIL10+/+小鼠的最终体重无差异，表明髓系AC缺失可防止体重增长受限。ACΔMYEIL10?/?小鼠还免受脾肿大和结肠缩短。在ACfl/flIL10?/?小鼠中，结肠组织促炎细胞因子（TNFα、IL1β）和趋化因子（CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL5）在8至24周期间显著升高，但这一升高在ACΔMYEIL10?/?小鼠中被消除。巨噬细胞标志物F480、中性粒细胞标志物MMP8及肠道炎症标志物COX2和S100A9在ACfl/flIL10?/?小鼠24周龄时升高，而ACΔMYEIL10?/?小鼠无此变化。此外，研究观察到性别差异，AC缺失在雄性中的保护作用可能更强。

3.2 髓系AC可能调控pSTAT3表达

组织学分析显示，ACfl/flIL10?/?与ACΔMYEIL10?/?小鼠在8周和24周龄的结肠炎严重程度评分无差异，COX2表达以及增殖标志物Ki67和凋亡标志物cleaved caspase-3均不受AC缺失影响。但ACfl/flIL10?/?小鼠肠道pSTAT3表达升高，而ACΔMYEIL10?/?小鼠中无此现象，提示髓系AC可能通过调节STAT3磷酸化参与肠道炎症调控。

3.3 髓系AC缺失改变结肠组织鞘脂水平

脂质组学分析显示，ACΔMYEIL10?/?小鼠在8周龄时结肠总神经酰胺水平升高，其中C16和C18神经酰胺显著增加，且C16神经酰胺在24周龄仍维持升高。相反，二氢鞘氨醇、鞘氨醇及二氢S1P和S1P在ACΔMYEIL10?/?小鼠中降低。鞘磷脂（sphingomyelin, SM）在两种基因型中均呈年龄依赖性下降，但ACΔMYEIL10?/?小鼠在24周龄时SM水平高于ACfl/flIL10?/?小鼠，尤其C18和C20 SM。此外，溶酶体SM（lyso-SM）在慢性疾病阶段的ACΔMYEIL10?/?结肠组织中亦降低。这些结果说明髓系细胞中的AC对结肠整体鞘脂代谢具有显著贡献。

3.4 髓系AC调节先天性和适应性免疫细胞向结肠组织的募集

流式细胞术结果显示，ACΔMYEIL10?/?小鼠脾脏巨噬细胞和循环单核细胞显著减少，但结肠巨噬细胞总数无变化。中性粒细胞在脾脏中于8周龄减少，但在ACΔMYEIL10?/?小鼠循环中显著升高；然而，结肠固有层和上皮内区室的中性粒细胞浸润在24周龄时显著减少，提示AC缺失可能通过减少趋化因子表达而限制中性粒细胞向结肠黏膜的募集。进一步分析巨噬细胞极化状态发现，M1样（MHC II+CD11c+）和M2样（CD206+）巨噬细胞在ACΔMYEIL10?/?小鼠的脾脏和结肠组织中于8周龄时减少，但24周龄时无显著差异。在适应性免疫方面，CD8+GranzymeB+细胞毒性T细胞在ACΔMYEIL10?/?小鼠脾脏（8周）和结肠组织（8周和24周）中减少。FOXP3+ Tregs总量未改变，但IFNγ+Tregs在血液和脾脏中减少，IL17A+Tregs在结肠LP中于8周龄减少。关键的是，Th1 T细胞在循环、脾脏和结肠LP中于24周龄显著减少，而Th17 T细胞在脾脏和结肠IEC中于8周龄减少、在循环中于24周减少。这些数据表明髓系AC可能通过间接机制影响效应T细胞的募集或分化。

四、讨论与结论

本研究表明，在两种结肠炎模型中（急性DSS诱导和慢性IL10缺陷），髓系AC缺失均具有保护作用。在IL10缺陷模型中，AC缺失降低了IL1β和CCL5表达，与DSS模型中降低CXCL1和IL17a的模式不同，提示不同模型下AC调控的炎症介质有所差异。既往对T细胞鞘脂代谢的研究显示，CerS4、CerS6或SPT缺失均可影响结肠炎进程，但关于髓系细胞中鞘脂代谢在慢性肠道炎症中作用的认识有限。本研究发现髓系AC缺失可降低pSTAT3表达，可能与S1P水平下降相关，因为S1P是STAT3磷酸化的重要调控因子。此外，AC缺失的巨噬细胞可能通过减少趋化因子和细胞因子分泌，以及降低MHC II表达，间接削弱效应T细胞的募集和活化。尽管组织学评分和COX2表达未见差异，但炎症标志物和免疫细胞浸润的显著下降仍表明AC是慢性结肠炎的潜在治疗靶点。

结论：髓系细胞中酸性神经酰胺酶缺失通过降低结肠组织炎症、增加神经酰胺水平、减少S1P生成以及损害中性粒细胞和效应性Th1/Th17 T细胞的募集，部分保护小鼠免受慢性结肠炎。AC有望成为炎症性肠病的新型治疗靶标。