无抗体核酸侧向流动检测技术可视化检测牛奶中肠道沙门氏菌扩增DNA的研究

《International Journal of Dairy Technology》：An antibody-free nucleic acid lateral flow assay (AF-NALFA) for visual detection of amplified DNA from Salmonella enterica in milk

　　

食品中肠道沙门氏菌污染仍然是一个重大的公共卫生问题。目前，其在牛奶中的检测仍主要依靠耗时的培养方法，而更快的免疫学方法（如酶联免疫吸附试验）和分子方法（如聚合酶链反应）常受到成本、基质干扰以及专门仪器需求的限制。为此，研究人员开发并评估了一种无抗体核酸侧向流动检测（AF-NALFA，antibody-free nucleic acid lateral flow assay），这是一种基于金纳米粒子（AuNP，gold nanoparticle）的探针介导平台，用于可视化检测纯培养物和人工污染的超高温处理（UHT，ultra-high-temperature）牛奶中四种肠道沙门氏菌血清型的扩增DNA。该检测采用AuNP偶联的寡核苷酸探针，通过碱基互补配对实现靶DNA的特异性识别。系统使用invA基因特异性探针及不对称PCR（aPCR，asymmetric PCR）产生单链DNA（ssDNA，single-stranded DNA）扩增子，用于直接可视化读取。分析灵敏度通过合成双链DNA和经qPCR定量的基因组DNA进行评估。在快速碱裂解（无需DNA纯化）处理人工污染UHT牛奶后，该检测进一步得到验证，并与平板计数法进行了比较。主要发现：AF-NALFA可在扩增后20分钟内实现特异性可视化检测；对合成DNA的分析检测限为10²拷贝/μL，与qPCR定量结果一致；在人工污染UHT牛奶中，AF-NALFA成功检出了实验条件下最低测试细菌浓度约1.67 cfu/mL的肠道沙门氏菌，且信号强度与DNA拷贝数及细菌载量相关；在评估的细菌面板内未观察到交叉反应。AF-NALFA是一种灵敏、经济的技术，可在无需最终读数设备的情况下可视化检测扩增的肠道沙门氏菌DNA。通过结合无抗体检测和简化样本处理，AF-NALFA为未来开发快速沙门氏菌筛查检测提供了一个有前景的原型框架；更广泛地，该平台有望未来应用于工业牛奶安全监测和质量控制。

食源性致病菌污染是日益严重的公共卫生问题。肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）是沙门氏菌病的病原体，包含2600多种血清型，主要通过污染食品或水传播。目前，食品中沙门氏菌的检测多依赖选择性培养，通常需要2–7天才能确认；免疫学方法虽快（约48小时），但面临抗体成本高、变异大、基质干扰和操作步骤繁琐等限制；分子方法如PCR虽然灵敏特异，却需要电泳或实时荧光定量PCR仪等专门设备进行结果判读。因此，亟需研发快速、简便、低成本且不依赖大型仪器的核酸检测平台。AF-NALFA是一种基于纳米金颗粒和寡核苷酸探针的侧向流动技术，此前已成功用于单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的检测。本研究将其适配到沙门氏菌，开发了能够可视化检测牛奶中该病原体扩增DNA的原型系统。

研究人员以invA基因（沙门氏菌侵袭蛋白相关基因）为分子靶标，利用不对称PCR生成以单链DNA为主的扩增产物，无需变性处理即可与AuNP标记的检测探针（DP）杂交，在侧向流动条上通过捕获探针（CP）和对照探针（CoP）形成可见的测试线（T线）和质控线（C线）。该平台使用硫醇化探针和生物素化探针，借助链霉亲和素固定在硝酸纤维素膜上，AuNP-探针偶联物沉积在玻璃纤维结合垫上。整个反应无需抗体、无需DNA纯化，也无需专用仪器进行最终结果判读。研究在纯培养的四种沙门氏菌血清型（鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌）中验证了特异性，并在人工污染的UHT牛奶中评估了实际应用性能，以平板计数作为细菌载量的参考。

主要关键方法如下：应用不对称PCR（aPCR）以20:1的引物比例扩增invA基因107 bp片段，产生单链DNA用于后续杂交；AF-NALFA采用硫醇化检测探针修饰的金纳米粒子（AuNP），通过序列特异性杂交捕获靶标，在硝酸纤维素膜上形成肉眼可见的信号；实时荧光定量PCR（qPCR）用于定量DNA拷贝数并建立标准曲线作为参考方法；人工污染商业UHT牛奶后采用快速碱性裂解提取DNA，无需纯化；平板计数法在沙门氏菌-志贺氏菌（SS）琼脂上测定活菌数；图像分析使用ImageJ软件量化T线信号强度，并设定基于背景信号平均值加3倍标准差的截断值（cut-off，4.67 a.u.）。样本来源包括ATCC标准菌株、实验室保藏菌株及商业UHT牛奶。

研究结果部分：
**1. 不对称PCR及AF-NALFA对沙门氏菌的检测性能**
通过琼脂糖凝胶电泳（2%，w/v）验证了aPCR产物，四种沙门氏菌血清型均出现107 bp特异性条带，而非沙门氏菌细菌（包括肠球菌、葡萄球菌、李斯特菌、假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等）无交叉扩增。将aPCR产物直接加入AF-NALFA试纸条，所有沙门氏菌样本均显示可见的T线和C线，阴性对照仅显示C线，证明该平台能够有效识别沙门氏菌靶DNA。

**2. AF-NALFA原型对沙门氏菌invA检测的分析性能与检测限**
通过qPCR对合成invA双链DNA进行定量，得到标准曲线方程Y = ?3.331X + 32.10，R² = 0.9972，线性关系良好。AF-NALFA对aPCR产物的检测显示，在10⁵至10²拷贝/μL浓度范围内均出现阳性T线，更低浓度及阴性对照无T线，因此以合成DNA确定的分析检测限为10²拷贝/μL。四种沙门氏菌血清型gDNA的qPCR扩增效率在94.13%–98.92%之间，对应的qPCR检测限为9.48至3.36拷贝/μL。通过定量gDNA稀释液，AF-NALFA在D1至D5稀释度（约10²拷贝/μL）可检测到T线信号，D6和D7为阴性；T线强度随稀释倍数增加呈显著线性下降（one-way ANOVA线性趋势分析，P < 0.0001）。

**3. AF-NALFA检测人工污染牛奶中的沙门氏菌**
人工污染UHT牛奶样本经快速碱裂解后直接进行aPCR和AF-NALFA检测，T线信号从D1至D8均可见，并随稀释倍数增加显著减弱（P < 0.0001）。平行平板计数显示D1至D7有不同数量的菌落形成单位（cfu），D8仅出现1个cfu，D9和D10无细菌生长。结合T线强度和菌落计数，AF-NALFA在实验条件下可检测的最低牛奶细菌浓度约为1.67 cfu/mL。

讨论部分总结：该研究证明了AF-NALFA作为无抗体检测平台的优势。与依赖抗体和标记引物的传统侧向流动核酸检测方法相比，AF-NALFA仅通过寡核苷酸探针与ssDNA的双重杂交实现识别，不依赖抗体、荧光标记或昂贵试剂，降低了成本和操作复杂性。其灵敏度与qPCR相当，且无需扩增后稀释步骤，避免了“钩状效应”和基质干扰。牛奶基质中的成功检测表明该方法对样本中抑制物具有一定耐受性，并且无需DNA纯化即可使用。aPCR产生ssDNA是该系统杂交检测的关键，研究人员指出该平台理论上可兼容能产生单链产物的其他等温扩增技术（如LAMP或RPA）。目前采用的aPCR仍需要热循环仪，未来若与等温扩增整合，将更利于现场应用。此外，现有细菌面板和牛奶基质验证尚有限，需要更多独立重复实验、不同批次牛奶和更广谱细菌株来确认重现性和特异性。

研究结论翻译：综上所述，这些结果支持AF-NALFA作为一种有前景的无抗体原型，用于可视化检测扩增的沙门氏菌DNA。在人工污染UHT牛奶中获得的结果提供了初步证据，支持该平台在牛奶快速分子筛查中的进一步评估。未来需要利用独立污染实验、不同牛奶批次和更广泛的细菌面板进行更多研究，以确定其可重复性及其在常规食品安全工作流程中的适用性。