《Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials》：Enhancing Antifungal Activity of Nitric Oxide-Releasing Polymers via the Incorporation of Piperine
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随着医院获得性感染以及抗生素和抗真菌耐药性的增加，亟需持续创新新型抗菌解决方案。为此，研究人员探索了内源性自由基气体一氧化氮（NO），因为一氧化氮在低水平下即可有效杀灭细菌，且不会产生显著的细胞毒性作用。生物材料可通过掺入一氧化氮供体分子如S-亚硝基硫醇（RS
随着医院获得性感染以及抗生素和抗真菌耐药性的增加，亟需持续创新新型抗菌解决方案。为此，研究人员探索了内源性自由基气体一氧化氮（NO），因为一氧化氮在低水平下即可有效杀灭细菌，且不会产生显著的细胞毒性作用。生物材料可通过掺入一氧化氮供体分子如S-亚硝基硫醇（RSNOs）来设计成一氧化氮释放材料。尽管一氧化氮释放材料表现出优异的细胞相容性和抗菌活性，但其对真菌物种的功效有限。本研究旨在通过将S-亚硝基硫醇类一氧化氮供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）释放的一氧化氮与天然抗真菌化合物胡椒碱（PIP）的释放相结合，并将其整合到一种市售生物医用聚合物CarboSil中。在本研究中，研究人员成功开发了一种聚合物平台，该平台不诱导细胞毒性，同时使两种细菌菌株和一种真菌菌株的黏附态和浮游态微生物负荷均实现统计学显著降低。该材料有望用于预防短期应用中的医院获得性感染和生物材料相关感染。
研究背景与目的
医院获得性感染（HAIs）是患者在医疗期间或医疗过程中获得的感染，会显著增加医疗成本、延长住院时间并导致发病率和死亡率上升。在拥有发达医疗体系的国家，高达10%的住院患者会发生HAIs。生物材料植入引发的感染是HAIs的重要驱动因素之一，而生物膜在生物材料表面的形成是感染发生和加剧的关键环节。生物膜的形成分为细菌黏附、生物膜形成、成熟和细菌分散等阶段。一旦成熟生物膜形成，其黏稠的胞外聚合物物质会物理和化学地屏蔽细菌，使有效抗生素剂量需求提高多达100倍，并且生物膜为细菌通过水平基因转移共享耐药基因提供了环境，加剧了全球抗生素耐药性问题。
鉴于生物膜形成始于微生物附着，防止初始附着成为预防生物膜发展的策略之一。一氧化氮（NO）是一种内源性自由基气体，负责血管舒张、细胞信号传导、防止血液凝固以及在血液中攻击病原体。由于NO半衰期短，通常不以其气体形式掺入，而是结合到称为一氧化氮供体的分子中，例如S-亚硝基硫醇（RSNOs）。虽然从生物材料释放NO对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种非常有效，但对真菌物种的效果较差，需要达到哺乳动物细胞毒性阈值10倍的NO供体剂量才能预防真菌感染。真菌感染虽少于细菌感染，但仍构成重大医疗负担并能形成生物膜。已有研究尝试组合NO释放与抗真菌表面，但多集中于传统抗真菌剂。
一些研究探索了替代性抗真菌剂，包括香料提取物。黑胡椒果实中的生物碱化合物胡椒碱（PIP）作为一种天然抗真菌剂显示出潜力，它能抑制白色念珠菌（C. albicans）的菌丝转变、增加其膜通透性、破坏线粒体膜电位并导致细胞内活性氧积累，同时对哺乳动物细胞无明显细胞毒性。此外，胡椒碱还能增强抗生素对细菌的活性。因此，研究人员开展本研究，旨在将来自S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）的NO释放与胡椒碱的释放相结合，开发一种兼具抗菌和抗真菌功效的新型聚合物平台，用于预防短期医疗植入物相关的感染。
关键技术方法
研究人员采用了多层聚合物薄膜的设计策略。首先合成SNAP晶体并通过化学发光法评估纯度。随后，以热塑性聚碳酸酯-氨基甲酸酯CarboSil为基础材料，采用溶剂浇铸法制备含有10 wt% SNAP的基底薄膜。为减少SNAP浸出并控制胡椒碱释放，在基底薄膜上进行多次浸涂包覆，最终确定方案为一层纯CarboSil涂层加五层含3 wt%胡椒碱的CarboSil涂层。利用紫外-可见分光光度法分别定量SNAP和胡椒碱的浸出量。使用基于化学发光法的Zysense一氧化氮分析仪280i测定NO释放通量。通过MTT法检测L929小鼠成纤维细胞的细胞毒性。通过平板计数法量化金黄色葡萄球菌（S. aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和白色念珠菌（C. albicans）的黏附和浮游状态微生物活力。
研究结果
3.1 SNAP浸出
为实现材料表面持久的NO释放，理想情况是NO供体分子保留在材料内部而非浸出到周围介质中。通过测试不同涂层材料（HydroThane 15、HydroThane 5、CarboSil、ChronoFlex、ChronoSil），发现CarboSil、ChronoFlex和ChronoSil涂层在48小时内均表现出较低的SNAP累积浸出率（分别为5.0%、4.5%和4.3%），这与其低吸水性有关。这三种涂层被选作后续测试材料。
3.2 一氧化氮释放
所有测试的涂层类型在48小时内均表现出接近生理范围的NO释放通量（最大4.5 × 10-10 mol cm-2 min-1，最小0.4 × 10-10 mol cm-2 min-1）。由于各涂层类型间NO释放无显著差异，选择全CarboSil系统（CarboSil基底加CarboSil涂层）进行后续测试。进一步确认，在最终设计中掺入胡椒碱并未对NO释放曲线产生不利影响。
3.3 胡椒碱对哺乳动物细胞的细胞毒性
为确保组合材料的生物安全性，研究人员评估了胡椒碱的细胞毒性。结果显示，L929成纤维细胞在暴露于1.0 mM胡椒碱溶液24小时后，存活率仍高于80%。因此，最终聚合物设计应确保24小时内胡椒碱浸出量不超过1.0 mM。
3.4 胡椒碱浸出
测试了不同胡椒碱浓度（1 wt%、2 wt%、3 wt%、4 wt%）的浸涂溶液。4 wt%组在24小时后的浸出液胡椒碱浓度超过1.0 mM安全阈值，而1 wt%、2 wt%和3 wt%组均未超标。因此，选择释放胡椒碱最多且低于安全阈值的3 wt%涂层进行后续测试。
3.5 薄膜对哺乳动物细胞的细胞毒性
最终薄膜设计（10 wt% SNAP-CarboSil基底 + 1层纯CarboSil涂层 + 5层3 wt% PIP-CarboSil涂层）的24小时浸提液处理L929成纤维细胞后，对照组、仅胡椒碱组、仅SNAP组以及SNAP+胡椒碱组的细胞存活率均超过70%，符合ISO 10993-5指南的可接受细胞毒性标准，表明该材料适用于短期生物医学应用。
3.6 对黏附细菌和真菌活力的影响
针对金黄色葡萄球菌，仅胡椒碱组无显著效果，而仅SNAP组和SNAP+胡椒碱组分别实现了2.1-log和2.7-log的黏附菌减少。针对表皮葡萄球菌，仅胡椒碱组无显著效果，仅SNAP组和SNAP+胡椒碱组分别实现了1.6-log和1.9-log的黏附菌减少。针对白色念珠菌，仅SNAP组无显著效果，而仅胡椒碱组和SNAP+胡椒碱组均实现了0.6-log的黏附真菌减少。结果表明，NO释放有效减少了细菌黏附，而胡椒碱则贡献了抗真菌活性，并且可能通过抑制金黄色葡萄球菌的MdeA外排泵增强了SNAP的抗菌效果。
3.7 对浮游细菌和真菌活力的影响
针对浮游态金黄色葡萄球菌，仅胡椒碱组无显著效果，仅SNAP组和SNAP+胡椒碱组分别实现了1.4-log和3.5-log的减少。针对浮游态表皮葡萄球菌，仅胡椒碱组无显著效果，仅SNAP组和SNAP+胡椒碱组均实现了0.4-log的减少。针对浮游态白色念珠菌，仅SNAP组无显著效果，仅胡椒碱组和SNAP+胡椒碱组分别实现了1.2-log和0.7-log的减少。这些结果与黏附实验趋势一致，进一步证实了NO的抗菌作用和胡椒碱的抗真菌及增效作用。
总结与结论
本研究成功证明，将来自S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）的一氧化氮（NO）释放与天然抗真菌剂胡椒碱（PIP）相结合，可以构建出一种对细菌和真菌病原体均有抑制作用的双功能抗菌表面。该聚合物材料显著减少了金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的黏附及活力，同时影响了表面相关和浮游状态的微生物群体。值得注意的是，尽管胡椒碱本身几乎没有内在抗菌活性，但它增强了SNAP的抗菌效力，这与先前关于其对金黄色葡萄球菌具有增效作用的报道一致。
该材料将一个成熟的NO释放平台与廉价且相对未被充分开发的抗真菌化合物胡椒碱相结合，在保持细胞相容性的同时实现了抗真菌和抗菌活性。材料在48小时内维持了接近生理水平的持续NO释放，SNAP浸出极少，胡椒碱释放浓度也被调整至既能有效减轻真菌负荷又不引起细胞毒性的水平。此外，暴露于材料浸提液后，L929成纤维细胞活力保持在70%的细胞毒性阈值以上，证实了该系统的生物相容性。综上所述，这些发现证明了这种NO和胡椒碱共释放聚合物作为预防医疗器械上微生物定植和早期生物膜形成策略的潜力。鉴于其聚合物组成、抗菌效力和良好的生物相容性，该材料可能特别适用于短期留置医疗器械，如导管，在这些器械上，细菌和真菌感染都是导致医疗相关并发症的重要原因。
尽管该材料在前24-48小时表现出生理水平的NO释放和抗菌活性，未来的设计应侧重于延长生理相关NO释放的时间并进行更长期的抗菌测试。通过抑制细菌和真菌的附着并降低其在周围的活力，这种聚合物表面有潜力减少给美国及全球医疗系统带来沉重负担的医院获得性感染和生物膜形成。
