慢性肢体威胁性缺血血运重建后线粒体功能无可塑性

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Chronic Limb-Threatening Ischemia Shows No Adaptability of Mitochondrial Function After Revascularisation

　　

外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）损害肢体灌注，导致以线粒体含量和呼吸功能改变为特征的肌病。由于缺血肌肉在不同PAD分期似乎表现出不同的适应性，研究人员研究了成功血运重建前后分期特异性的骨骼肌线粒体功能。研究人员从32例患者——21例间歇性跛行（intermittent claudication，IC）和11例慢性肢体威胁性缺血（chronic limb-threatening ischemia，CLTI）——中获取腓肠肌和股外侧肌肌肉活检样本，采集时间为成功血运重建前及术后6周。采用高分辨率呼吸计量法（high-resolution respirometry，HRR）评估线粒体呼吸功能。HRR结果以柠檬酸合酶活性（citrate synthase activity，CSA）作为线粒体含量标志物进行归一化。个体间变异以腓肠肌与股外侧肌呼吸比值（“GV比值”）表示。在IC组中，血运重建后腓肠肌CSA归一化的线粒体呼吸功能显著降低，同时GV比值显著下降。相比之下，CLTI患者术前至术后CSA归一化呼吸功能或GV比值均无显著变化，但线粒体含量经血运重建后显著改善。成功血运重建后6周，线粒体呼吸功能在较轻PAD分期（如IC）中仅表现出适度适应，而更晚期阶段（CLTI）则无功能性适应。这些发现表明，线粒体适应能力具有分期依赖性，且可能需要超越单纯血运重建的靶向治疗策略，尤其是在CLTI中。

论文解读：慢性肢体威胁性缺血血运重建后线粒体功能适应性研究

外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）是全球领先的心血管疾病之一，给医疗系统带来日益沉重的负担。临床上PAD按严重程度分层：较轻阶段即间歇性跛行（intermittent claudication，IC），表现为劳力性疼痛且休息后缓解；最严重阶段即慢性肢体威胁性缺血（chronic limb-threatening ischemia，CLTI），以持续性静息痛、营养性病变、踝臂指数（ankle brachial pressure index，ABPI）低于0.4等为特征。从IC向CLTI的进展由糖尿病、高血压、吸烟和老龄化等心血管危险因素驱动。在病理生理层面，PAD各分期在分子、亚细胞和细胞水平上存在差异。动脉狭窄减少骨骼肌灌注，限制氧和营养输送，促进肌病发生；反复缺血-再灌注循环进一步损害细胞代谢，随着疾病进展加剧线粒体病和肌病。已有研究显示，晚期PAD（如CLTI）线粒体呼吸适应能力有限，而单纯股浅动脉狭窄的轻度PAD患者在血运重建后缺血腓肠肌表现出适应性。然而，目前缺乏对不同PAD分期血运重建后线粒体功能适应性的系统比较。因此研究人员假设，成功血运重建后线粒体呼吸的适应能力在晚期PAD中受损，并在此研究中进行验证。

研究人员在柏林Charité-Universit?tsmedizin医学中心开展了一项前瞻性队列研究，纳入32例症状性PAD患者，其中21例IC和11例CLTI。所有患者在成功血运重建前及术后6周接受腓肠肌（gastrocnemius muscle，GM）和股外侧肌（vastus lateralis muscle，VLM）穿刺活检。血运重建技术分为开放手术、腔内手术及两者结合的杂交手术。研究获得伦理委员会批准（EA4/139/16），所有受试者签署知情同意书。研究人员通过高分辨率呼吸计量法（high-resolution respirometry，HRR）评估线粒体呼吸功能，以柠檬酸合酶活性（citrate synthase activity，CSA）作为线粒体含量标志物对呼吸值进行归一化，并采用腓肠肌与股外侧肌呼吸比值（“GV比值”）作为个体内参考以减小个体间差异。主要比较指标为血运重建前后各呼吸状态（MOctL、MOctP、P、ET、Rot）的变化，包括绝对呼吸值、CSA归一化呼吸值以及GV比值。统计采用非参数检验方法，包括Wilcoxon配对检验、Mann–Whitney U检验和卡方检验，p值小于0.05视为显著。

主要研究结果分四个部分。在患者特征方面，两组的基线人口学特征、性别分布、合并症和用药情况具有可比性。CLTI队列中72.7%患者存在静息痛，72.7%有溃疡或慢性伤口。术后超声确认所有患者血运重建成功，且ABPI和步行距离显著改善（IC：p=0.001；CLTI：p=0.046）。CLTI合并伤口的8例患者术后伤口愈合均有改善，其中7例完全愈合。在线粒体含量标志物方面，CLTI组术后缺血腓肠肌CSA显著增加（p=0.043），而IC组及两组的股外侧肌CSA均无显著变化。在线粒体呼吸功能方面，两组腓肠肌和股外侧肌各呼吸状态的绝对呼吸值在血运重建前后均无显著差异。然而，将呼吸值归一化至CSA后，IC组腓肠肌中ADP刺激的最大呼吸（MOctP，p=0.001）和复合体I抑制后的复合体II呼吸（Rot，p=0.031）在术后显著降低；CLTI组无此类术后变化。此外，术后两组的电子传递能力（ET）存在显著组间差异（p=0.045）。在GV比值方面，IC组术后MOctP（p=0.022）、氧化磷酸化能力（P，p=0.003）、ET（p=0.004）和Rot（p=0.013）显著降低，而CLTI组血运重建后各指标均无显著变化。两组的CSA GV比值在术后均无变化。

上述结果表明，线粒体呼吸功能的适应性在PAD中呈现出明显的分期依赖性。IC患者在血运重建后CSA归一化的复合体I和II呼吸下降至接近先前研究中对照水平，提示功能趋向正常化；而CLTI患者尽管线粒体含量增加，但线粒体呼吸功能未表现出适应性改变，提示晚期PAD中长时间缺血损伤限制了线粒体的可塑性。这种缺乏适应的现象可能归因于多种因素。晚期PAD中更严重的缺血-再灌注损伤进一步损害线粒体功能并降低细胞修复和适应潜力；线粒体病导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加和氧化应激加剧，当ROS超过阈值时，保护性线粒体激素效应和抗氧化刺激无法发生。微循环障碍可能仅部分可逆，进一步限制组织适应。组学分析显示CLTI、IC和对照之间存在显著的基因、蛋白质表达和血清代谢物差异，支持CLTI构成具有有限适应能力的独立临床实体。

在方法学层面，该研究使用了几个关键技术手段：高分辨率呼吸计量法采用Oxygraph-2k仪器在37°C恒温下进行，通过底物-解偶联剂-抑制剂滴定（substrate-uncoupler-inhibitor titration，SUIT）方案依次诱导不同呼吸状态，包括LEAK态（苹果酸和辛酰肉碱）、复合体I连接呼吸（ADP）、复合体I和II联合驱动的氧化磷酸化（丙酮酸和琥珀酸）、最大电子传递（FCCP滴定）以及复合体II呼吸（鱼藤酮抑制复合体I）；CSA测定采用分光光度法在412nm和25°C下进行，并将所有呼吸值归一化至CSA以校正线粒体含量差异；GV比值以腓肠肌与股外侧肌的呼吸比值作为个体内参照，减小个体间变异对结果的影响。研究样本来源于Charité-Universit?tsmedizin Berlin血管外科门诊连续筛查的症状性PAD患者。

讨论部分指出，CLTI患者缺乏线粒体适应性可能与疾病晚期持续缺血损伤导致的肌病、神经病变以及ROS相关保护机制失效有关。既往研究如Ryan等人通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和HRR发现截肢期CLTI患者线粒体蛋白组下调及脂肪酸和碳水化合物通路功能受损，支持适应能力随疾病进展而降低的观点。Wilburn等在IC患者血运重建后6个月观察到复合体I–IV呼吸增加，但该研究采用不同的SUIT方案和更长的术后随访期，且缺乏对照组，直接可比性有限。Pedersen等在糖尿病CLTI患者中仅发现琥珀酸驱动的复合体II呼吸在术后6周显著增加。上述差异可能与患者异质性、随访时间及方案不同有关。该研究局限性包括CLTI样本量较小、仅使用单一线粒体含量标志物、糖尿病患者的ABPI可能因血管钙化而高估灌注、缺乏匹配的非PAD对照组，以及未记录术后6周内的体力活动情况。

总而言之，该研究为PAD患者骨骼肌线粒体功能血运重建后的分期依赖性适应能力提供了证据。术后线粒体呼吸的改善仅在间歇性跛行患者中观察到，表明线粒体的适应能力主要限于PAD的早期阶段。相比之下，慢性肢体威胁性缺血患者未表现出显著的线粒体适应，提示晚期PAD的长期缺血损伤限制了线粒体的适应潜力。这些发现强调了早期诊断和及时干预的重要性。未来需要更大规模队列和更长随访时间的研究来证实这些结果，并进一步阐明晚期PAD中线粒体适应能力受损的机制。