《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Adipose Mesenchymal Stem Cells Secreted Exosomal miR-26a-5p Ameliorate Renal Fibrosis via Inhibiting Glycolysis and Ferroptosis in Renal Interstitial Fibrosis
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肾纤维化（renal fibrosis）是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的关键特征，涉及向有氧糖酵解（aerobic glycolysis）的代谢转变，并常伴随铁死亡（ferroptosis），即一种铁依赖性细胞死亡形式。
肾纤维化（renal fibrosis）是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的关键特征，涉及向有氧糖酵解（aerobic glycolysis）的代谢转变，并常伴随铁死亡（ferroptosis），即一种铁依赖性细胞死亡形式。本研究探讨了脂肪间充质干细胞来源外泌体（adipose mesenchymal stem cell-derived exosomes, AMSC-exo）在肾纤维化中的治疗潜能。采用单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）小鼠模型和缺氧处理的HK-2细胞，研究人员评估了纤维化、糖酵解、线粒体形态和铁死亡。研究人员进行了miRNA测序、双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assays）和转录组测序（transcriptome sequencing），以鉴定关键外泌体miRNA和下游通路。AMSC-exo显著减轻UUO诱导的纤维化，并抑制肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells, TECs）中的糖酵解和铁死亡。miR-26a-5p在AMSC-exo中高度富集，并下调6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3, Pfkfb3），后者是糖酵解和铁死亡的关键调节因子。敲低miR-26a-5p显著削弱AMSC-exo的肾脏保护作用，而抑制Pfkfb3可逆转miR-26a-5p缺失诱导的效应。这些发现表明，AMSC-exo通过递送miR-26a-5p抑制Pfkfb3，从而抑制糖酵解重编程和铁死亡，缓解肾纤维化，并提示miR-26a-5p/Pfkfb3轴是肾纤维化的潜在治疗靶点。
肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis）是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）进展的重要病理特征，也是影响预后的主要因素。既有研究显示，肾纤维化涉及肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells, TECs）死亡和去分化，表现为上皮标志物减少、间充质标志物增加；TECs内Notch、Wnt和Hedgehog信号升高可诱发去分化。虽然TECs并不直接转化为肌成纤维细胞，但可通过促进炎症和胶原沉积参与纤维化。转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1, TGF-β1）可促进纤维状胶原生成，并维持细胞死亡和去分化等有害过程。当前抗纤维化治疗在逆转或阻止肾纤维化进展方面效果有限，因此需要探索新的治疗策略。脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells, AMSCs）具有促血管生成、免疫调节、抗炎和支持细胞功能等治疗特性，相关临床前研究和临床试验逐渐增多。外泌体（exosomes）作为膜结合囊泡，是细胞间通讯的重要信使，具有低免疫原性和生物相容性，相比细胞治疗更安全、更具靶向性；间充质干细胞来源外泌体在组织修复、再生及抑制肿瘤进展方面显示潜力。TECs存在代谢悖论：其能量供应依赖线粒体脂肪酸氧化（fatty acid oxidation, FAO），但在短暂缺氧后，FAO被显著抑制且持续时间超过缺氧刺激本身，而碳水化合物氧化不能补偿。这种代谢限制迫使存活TECs发生表型转换，包括细胞骨架重排、细胞外基质蛋白产生增加和糖酵解上调，并可能促进铁死亡（ferroptosis）。然而，AMSC-exo调控TECs代谢及其对铁死亡的影响尚不清楚。本研究旨在鉴定和量化AMSC-exo内容物，并在UUO小鼠模型及缺氧诱导的HK-2细胞模型中探讨其调控糖酵解和铁死亡的潜在通路，以阐明AMSC-exo影响TECs代谢和铁死亡的机制，为肾纤维化治疗提供新策略。
研究人员使用单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）小鼠模型和缺氧处理的人近端肾小管上皮细胞（human proximal tubular cells, HK-2），评估纤维化、糖酵解、线粒体形态和铁死亡；通过miRNA测序、双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）和转录组测序鉴定关键外泌体miRNA及下游通路。结果显示，AMSC-exo显著减轻UUO诱导的纤维化，并抑制TECs中的糖酵解和铁死亡。miR-26a-5p在AMSC-exo中高度富集，并下调6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3, Pfkfb3）。敲低miR-26a-5p可显著削弱AMSC-exo的肾脏保护作用，而抑制Pfkfb3可逆转miR-26a-5p缺失诱导的效应。研究结论表明，AMSC-exo通过递送miR-26a-5p抑制Pfkfb3，从而抑制糖酵解重编程和铁死亡，缓解肾纤维化；miR-26a-5p/Pfkfb3轴可作为肾纤维化的潜在治疗靶点。该研究为AMSC-exo治疗肾纤维化提供了机制依据，并提示代谢重编程与细胞死亡通路之间的相互作用可能是干预肾损伤的重要方向。
关键技术方法：研究人员采用脂肪间充质干细胞（AMSCs）来源外泌体（AMSC-exo）分离与表征体系，包括透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blot。建立UUO小鼠模型，使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，来源于Nanjing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.，设假手术、UUO+PBS及UUO+AMSC-exo组，7天后取材；动物实验经Xuzhou Medical University IACUC批准。体外使用HK-2细胞，来源于ScienCell Research Laboratories, USA，以1% O
2缺氧24 h。采用miRNA测序、转录组测序、TargetScan与miRWalk预测、双荧光素酶报告基因实验、RT-qPCR、Western blot、HE/Masson染色、α-SMA免疫组化、Transwell迁移、EdU增殖、乳酸检测、TEM线粒体观察、MitoSOX和JC-1检测评估机制。
研究结果如下。
3.1 AMSC-exo的表征（Characterization of AMSC-Exo）
通过TEM观察到AMSC-exo为典型双层膜囊泡，粒径约50–200 nm；NTA用于验证颗粒数量和粒径分布；Western blot显示外泌体标志物CD9、Tsg101和CD81阳性，而阴性标志物Calnexin未检测到，提示细胞内细胞器污染较少。RT-qPCR显示，在缺氧HK-2细胞中Hif-1α、α-SMA、collagen和TGF-β显著上调，而AMSC-exo处理可逆转这一趋势，提示其具有对抗缺氧诱导肾纤维化和炎症的治疗潜力。
3.2 AMSC-exo改善UUO模型中的肾脏缺氧和纤维化（AMSC-Exo Ameliorates Renal Hypoxia and Fibrosis in a UUO Model）
研究人员建立UUO小鼠模型，Western blot显示UUO组肾脏HIF-1α（hypoxia-inducible factor alpha）和α-SMA（α-smooth muscle actin）较假手术组显著上调。HE和Masson染色显示，假手术组结构正常，UUO组在损伤7天时出现肾小管扩张、TECs凋亡、萎缩、轻度和散在炎症细胞浸润及有限纤维化。AMSC-exo处理可显著减少这些病理变化，包括减轻肾小管扩张、缓解TECs损伤、改善纤维化并减少炎症细胞浸润。α-SMA免疫组化证实UUO组表达增加，AMSC-exo可有效抑制。研究提示，AMSC-exo可能通过改善氧合、减少纤维化和减轻炎症来显著减轻UUO小鼠肾损伤。
3.3 AMSC-exo改善纤维化并增强HK2增殖和迁移（AMSC-Exo Ameliorates Fibrosis and Enhances HK2 Proliferation and Migration In Vitro）
体外实验中，缺氧HK-2细胞HIF-1α和α-SMA蛋白水平较对照增加，AMSC-exo处理可部分逆转，降低HIF-1α和α-SMA表达，提示减轻缺氧和纤维化。Collagen I和TGF-β1在缺氧下显著升高，AMSC-exo处理后显著降低。Transwell实验显示，缺氧处理使迁移较对照降低45.77%，AMSC-exo处理后迁移降低幅度为23.61%。EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）增殖实验显示，对照组增殖率为61.20%±2.90%，缺氧组为12.02%±5.78%，缺氧+AMSC-exo组为38.99%±1%，表明AMSC-exo可显著恢复缺氧抑制的HK2细胞增殖。结论为AMSC-exo可减轻纤维化并增强HK2细胞增殖和迁移。
3.4 miR-26a-5p被鉴定为AMSC-exo中的候选调节因子（miR-26a-5p Identifies as a Candidate Regulator in AMSC-Exo）
为解析AMSC-exo抗纤维化机制，研究人员进行miRNA测序，发现五种最丰富miRNA：miR-26a-5p、miR-150-5p、miR-1301-3p、miR-193a-3p和miR-33a-3p，合计占全部miRNA近48%。结合miRWalk和TargetScan数据库分析，Pfkfb3被鉴定为miR-26a-5p的潜在靶基因。研究人员制备miR-26a-5p抑制剂转染的AMSCs（miR-26a-5pIN-AMSC）和NC转染AMSCs（NC-AMSC），并分离miR-26a-5pIN-AMSC-exo和NC-Exo。RT-qPCR证实miR-26a-5p在miR-26a-5pIN-AMSC中表达受抑，双荧光素酶报告实验证实Pfkfb3为miR-26a-5p靶点。在缺氧HK2细胞和UUO小鼠中，敲低miR-26a-5p可阻断AMSC-exo降低Pfkfb3水平，并逆转AMSC-exo诱导的细胞迁移和增殖增加。HE和Masson染色显示，敲低miR-26a-5p加重肾损伤和纤维化，并伴随Pfkfb3上调。结论为AMSC-exo通过miR-26a-5p下调Pfkfb3而发挥肾脏保护作用。
3.5 AMSC-exo通过靶向Pfkfb3抑制HK2细胞糖酵解减轻肾纤维化（AMSC-Exo Attenuates Renal Fibrosis by Suppressing Glycolysis in HK2 Cells Targeting Pfkfb3）
TECs对肾功能重要且能量需求高，缺氧可促使其转向效率较低的有氧糖酵解。研究人员通过RNA测序比较UUO和假手术组，火山图显示3377个上调基因和2646个下调基因，Reactome富集分析用于识别差异表达基因中富集的代谢通路，并绘制热图。RT-qPCR显示，敲低miR-26a-5p可调控关键糖酵解检查点酶，如己糖激酶2（hexoskinase 2, HK2）、肌肉型磷酸果糖激酶（phosphofructokinase, muscle type, PFKM）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）；AMSC-exo处理的HK2细胞和UUO小鼠中这些酶显著下调。Western blot与mRNA结果一致，缺氧和UUO组HK2、PFKM和LDHA蛋白显著升高，AMSC-exo处理后明显降低。乳酸检测显示，miR-26a-5pIN-Exo组乳酸浓度相对较高，而AMSC-exo处理显著降低乳酸生成。结果支持AMSC-exo通过miR-26a-5p靶向Pfkfb3调节HK2细胞糖酵解，并可能促进肾纤维化减轻。
3.6 Pfkfb3在铁死亡和肾纤维化中的潜在作用（Potential Role of Pfkfb3 in Ferroptosis and Renal Fibrosis）
Pfkfb3作为关键糖酵解酶，被认为参与调控铁死亡。转录组分析显示UUO组Pfkfb3显著上调。通过TEM发现UUO和miR-26a-5pIN-Exo组存在线粒体损伤，而AMSC-exo可保护线粒体，证实UUO和miR-26a-5pIN-Exo组线粒体破坏，AMSC-exo可减轻该破坏；敲低miR-26a-5p导致Pfkfb3升高，并加剧铁死亡过程。JC-1染色证实缺氧和miR-26a-5pIN-Exo组线粒体功能障碍增加；MitoSOX分析显示线粒体超氧化物产生在缺氧和miR-26a-5pIN-Exo组升高。RT-qPCR显示，与AMSC-exo处理组相比，缺氧和UUO组中保护性铁死亡调节因子谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）显著下调，而铁死亡执行相关酶酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4）上调；敲低miR-26a-5p加重这些变化。使用Pfkfb3抑制剂PFK15进行挽救实验，Western blot显示抑制Pfkfb3可显著逆转miR-26a-5p敲低诱导的效应，包括降低Pfkfb3和HK2表达、恢复GPX4水平并抑制ACSL4表达。结果表明，Pfkfb3是miR-26a-5p下游关键功能介质，将TECs中的糖酵解重编程与铁死亡连接起来。
讨论部分总结：本研究探讨AMSC-exo减轻肾损伤的治疗潜力。生物信息学分析鉴定miR-26a-5p为AMSC-exo的重要成分，并验证其与Pfkfb3相互作用；Pfkfb3是TECs中糖酵解和铁死亡的关键调节因子。研究数据表明，AMSC-exo通过调控miR-26a-5p/Pfkfb3轴，调节TECs糖酵解和铁死亡，从而减轻肾纤维化。研究采用7天UUO模型，以关注与机制研究相关的早期纤维化事件；此阶段已出现肌成纤维细胞活化（如α-SMA增加）和细胞外基质沉积启动，而整体组织结构相对保留，有利于评估TECs早期分子和代谢改变；14天等更长时间通常与晚期纤维化和广泛组织损伤相关，可能掩盖早期调控机制。既有研究显示间充质干细胞来源外泌体具有抗纤维化潜力，本研究进一步提出特定miRNA介导的代谢调控机制。研究人员发现AMSC-exo可改善缺氧条件下TEC存活和功能，miR-26a-5p在AMSC-exo中高度富集，抑制miR-26a-5p可显著削弱保护作用，说明其功能重要性。Pfkfb3是miR-26a-5p下游靶点，在糖酵解调控中处于中心地位，而有氧糖酵解代谢重编程与肾纤维化相关。缺氧和UUO诱导HK2、PFKM、LDHA在mRNA和蛋白水平上调，并伴随乳酸生成增加，提示糖酵解增强；AMSC-exo处理显著逆转这些变化。研究还提示Pfkfb3可作为TECs中代谢重编程与铁死亡调控之间的功能连接。能量代谢紊乱、ROS过度产生和线粒体功能障碍可引发铁死亡；铁死亡是铁依赖性脂质过氧化和氧化应激驱动的调节性细胞死亡。UUO小鼠肾脏出现形态破坏和线粒体减少，AMSC-exo处理可对抗这些有害效应；miR-26a-5p敲低升高Pfkfb3，改变关键铁死亡酶表达并增加TECs线粒体ROS，最终加重细胞坏死；挽救实验支持Pfkfb3的因果作用。总体模型为：AMSC-exo将miR-26a-5p递送至TECs，抑制Pfkfb3表达，减弱糖酵解重编程并抑制铁死亡，最终减轻肾纤维化。
研究结论翻译：总之，AMSC-exo通过miR-26a-5p/Pfkfb3轴抑制TECs中的糖酵解和铁死亡，从而减轻肾纤维化。本研究为AMSC-exo的治疗潜力提供了新的机制见解，并确定了治疗肾纤维化的一个有前景的靶点。
